馬雅欽，高瑞萍,2，劉 嘉，趙國(guó)華,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563000；3.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復(fù)合物的體外穩(wěn)定性

馬雅欽1，高瑞萍1,2，劉 嘉1，趙國(guó)華1,3,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.遵義醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 遵義 563000；3.重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400715）

為研究燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復(fù)合物在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性，采用真空冷凍干燥法制備燕麥β-葡聚糖-表沒食子兒茶素沒食子酸酯復(fù)合物。在模擬胃腸液中通過不同pH值和復(fù)合物質(zhì)量濃度，探討在胃腸液中pH值和復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)于復(fù)合物穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明：在胃液和腸液中，pH值越低，復(fù)合物越穩(wěn)定。由于進(jìn)食會(huì)使得胃腸液的pH值增大，表明在禁食狀態(tài)下復(fù)合物狀態(tài)更穩(wěn)定。復(fù)合物質(zhì)量濃度越大，其在胃腸液中的穩(wěn)定性越高，且達(dá)到在0.8 mg/L時(shí)，180 min孵育后復(fù)合物穩(wěn)定性均達(dá)到80%以上。由此表明可以通過適當(dāng)增大復(fù)合物的質(zhì)量濃度來提高胃腸液的穩(wěn)定性。

燕麥β-葡聚糖；表沒食子兒茶素沒食子酸酯；復(fù)合物；模擬胃腸液；穩(wěn)定性

目前，膳食纖維與多酚形成的復(fù)合物在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的應(yīng)用備受關(guān)注[1]。多酚和多糖可以通過氫鍵、疏水相互作用、共價(jià)鍵相互作用結(jié)合[2]。多糖多酚復(fù)合物在調(diào)節(jié)胃腸道中多酚的游離濃度方面起著重要的作用[3-6]。燕麥β-葡聚糖作為一種可溶性膳食纖維，主要以細(xì)胞結(jié)構(gòu)成分的形式存在[7-10]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是茶多酚中主要功能成分，具有增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抗氧化性、抗癌、降血糖血脂等生理功能[10-15]。前期研究表明β-葡聚糖可吸附茶多酚形成復(fù)合物[16]，而且在合適濃度下二者的復(fù)合作用在產(chǎn)物的抗氧化性影響方面表現(xiàn)為增效作用[17]。人工模擬胃腸液中pH值和兒茶素濃度對(duì)其穩(wěn)定性具有較大影響[18]。但pH值和復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)于燕麥β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物的影響尚不清楚。利用燕麥β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物為實(shí)驗(yàn)材料，通過不同pH值梯度和不同復(fù)合物質(zhì)量濃度的模擬胃腸液，探討在胃腸液中pH值和復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)于復(fù)合物穩(wěn)定性的影響，以期為探討β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物的體內(nèi)生物學(xué)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕麥β-葡聚糖 鄭州荔諾生物科技公司。

EGCG 杭州禾田生物科技有限公司；胃蛋白酶（1∶10 000）、胰蛋白酶（1∶1 000） 美國(guó)Sigma公司；色譜甲醇 天津四友化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為分析純 成都科龍?jiān)噭┯邢薰尽?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

WS-26恒溫水浴鍋 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；PB-10標(biāo)準(zhǔn)型電化學(xué)分析儀、pH計(jì)（酸度計(jì)） 德國(guó)賽多利斯公司；ALPHA 1-4/2 -4LSC真空冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ公司；LC-20A高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 燕麥β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物制備

參照實(shí)驗(yàn)前期的方法制備燕麥β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物[16]。將2 mL 0.7 mg/mL的EGCG和6 mL 0.5 mg/mL葡聚糖（均溶于pH 5.80、0.1 mol/L的PBS溶液）置于經(jīng)處理的透析袋內(nèi)，將透析袋浸入30 mL pH 5.80、0.1 mol/L的PBS溶液，50 ℃透析16 h后將透析袋于流水透析24 h后再用超純水透析24 h以除去其中的磷酸鹽。把透析袋內(nèi)溶液進(jìn)行冷凍干燥得復(fù)合物，于4 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 EGCG的測(cè)定

游離的E GCG采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）方法測(cè)定。具體測(cè)定條件參考肖俊松等[19]并進(jìn)行優(yōu)化：色譜柱為Hypersil BDS（4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相A為100%甲醇，流動(dòng)相B為2%乙酸溶液，采用等度洗脫10 min，流動(dòng)相由甲醇（A）、2%的乙酸（B），體積比為25∶75，流速0.9 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm。復(fù)合物中EGCG的含量測(cè)定參照Tosh等[21]的酸水解方法并加以改進(jìn)，稱取100 mg在1.3.1節(jié)中制備的復(fù)合物溶解在100 mL超純水中，加1.0 mol/L的鹽酸調(diào)至pH 1.0，在70 ℃孵育50 min，冰浴中冷卻至室溫，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)至中性pH 6～7，將溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，HPLC測(cè)定EGCG含量即為復(fù)合物中的EGCG含量[20]。

1.3.3 復(fù)合物穩(wěn)定性表示與計(jì)算

復(fù)合物的穩(wěn)定性用復(fù)合物中EGCG的保留率表示，按照下式計(jì)算：

1.3.4 模擬胃腸液的制備

參照Hussain等[22]的方法配制胃腸液。模擬胃液的配制方法是稱取3.2 g胃蛋白酶和7 mL 37% HCl加入1 L的容量瓶，用超純水定容；模擬腸液的配制方法是稱取6.8 g磷酸二氫鉀溶于1 L超純水，加入3.2 g胰蛋白酶，NaOH調(diào)節(jié)pH 6.8。

1.3.5 體外模擬胃腸液的pH值對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

用HCl和NaOH對(duì)胃腸液的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，使胃液pH值為1.5～4.0，腸液pH值為5～8，稱取12.5 mg復(fù)合物分別溶于25 mL不同pH值的胃液和腸液配成0.5 mg/mL的溶液，搖勻，于37 ℃保溫30～180 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后測(cè)定游離的EGCG。

1.3.6 復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)其在模擬胃腸液中穩(wěn)定性的影響

分別稱取12.5、15、17.5、20、22.5、25 mg復(fù)合物于pH 1.5的胃液和pH 6.8的腸液配制0.5～1.0 mg/mL的溶液，于37 ℃保溫30～180 min。經(jīng)0.45 μm濾膜后HPLC測(cè)定解離的EGCG的量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，以復(fù)合物穩(wěn)定性作為最終數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)結(jié)果以來表示。利用Origin作圖軟件，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，復(fù)合物穩(wěn)定性為縱坐標(biāo)，得出不同因素對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性影響的數(shù)據(jù)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體外模擬胃腸液pH值對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響

圖1 體外模擬胃液的pH值對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響Fig.1 Time-dependent effect of in vitro SGF pH on the stability of the complex

由圖1可知，體外模擬胃液pH值變化對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響較明顯。這可能是由于燕麥β-葡聚糖在酸性環(huán)境下易發(fā)生水解[9]以及低pH值導(dǎo)致β-葡聚糖構(gòu)象發(fā)生變化引起的[23]。隨著孵育時(shí)間的變化，復(fù)合物逐漸解離，穩(wěn)定性逐漸減弱。隨著胃液pH值增大，復(fù)合物穩(wěn)定性逐漸增大。如在30 min時(shí)，pH值為4時(shí)復(fù)合物穩(wěn)定性變化量是pH值為1.5時(shí)的3.44倍；在180 min時(shí)，前者是后者的2.79倍。說明pH值增大使得復(fù)合物的穩(wěn)定性降低，即燕麥β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物中隨著pH值的降低，復(fù)合物穩(wěn)定性越高。參照之前的研究[16]，復(fù)合物兩者之間主要由于氫鍵作用相結(jié)合。在酸性條件下，氫離子濃度較高，有機(jī)物多以分子形式存在，分子形式有利于氫鍵的形成，所以在pH值越低的情況下越容易形成氫鍵，復(fù)合物越穩(wěn)定。由于空腹下胃液的pH值為1.5左右，且進(jìn)食會(huì)使得胃液的pH值增大[24]?？膳袛嘣诮碃顟B(tài)下復(fù)合物在胃液中相對(duì)進(jìn)食狀態(tài)而言較穩(wěn)定。此外，在孵育的前30 min，復(fù)合物穩(wěn)定性變化最大，變化量均超過總變化量的50%以上。即在作用前30 min，模擬胃液對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性影響最為顯著。物質(zhì)在胃液中停留的時(shí)間一般為90 min左右[25]，但停留時(shí)間也會(huì)因條件發(fā)生改變。通過縮短復(fù)合物在胃液中停留的時(shí)間，可以減少?gòu)?fù)合物中EGCG的損失。由圖2可知，體外模擬腸液中pH值變化對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響較明顯。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，復(fù)合物穩(wěn)定性降低，即解離的EGCG量逐漸增大。隨著模擬腸液pH值增大，復(fù)合物穩(wěn)定性逐漸降低。如在30 min時(shí)，pH值為8時(shí)復(fù)合物穩(wěn)定性變化量是pH值為5時(shí)的2.48倍；在180 min時(shí)，前者是后者的2.02倍。由于兒茶素類在偏堿性條件下不穩(wěn)定[26]，這可能是導(dǎo)致復(fù)合物穩(wěn)定性降低的原因之一。由于進(jìn)食會(huì)使得腸液pH值增大[24]，由此可推測(cè)在禁食狀態(tài)下復(fù)合物在腸液中的穩(wěn)定性較高。

圖2 體外模擬腸液的pH值對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響Fig.2 Time-dependent effect of in vitro SIF pH on the stability of the complex

2.2 復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)其在體外模擬胃腸液中穩(wěn)定性的影響

圖3 體外模擬胃液中復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響Fig.3 Time-dependent effect of the concentration of the complex on its stability in SGF in vitro

由圖3可知，體外模擬胃液中復(fù)合物質(zhì)量濃度變化對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響顯著，其原因可能是燕麥β-葡聚糖在酸性環(huán)境下容易發(fā)生部分水解[24]，復(fù)合物質(zhì)量濃度的提高，使得未發(fā)生水解的燕麥β-葡聚糖提高，由氫鍵與EGCG復(fù)合，復(fù)合物穩(wěn)定性隨之提高。隨著孵育時(shí)間的變化，復(fù)合物逐漸解離，穩(wěn)定性逐漸降低；隨著復(fù)合物質(zhì)量濃度增加，復(fù)合物穩(wěn)定性逐漸增大。如在30 min時(shí)，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)復(fù)合物穩(wěn)定性變化量是質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí)復(fù)合物變化量的3.22倍；在180 min時(shí)，前者是后者的3.17倍。因此，增大復(fù)合物在模擬胃液中的含量，可以增大復(fù)合物在胃液中的穩(wěn)定性。在孵育的前30 min，復(fù)合物穩(wěn)定性變化量最大，變化量均超過總變化量的50%以上，減少?gòu)?fù)合物在胃液中的停留速度，有利于復(fù)合物的保留。孵育180 min后，復(fù)合物質(zhì)量濃度高于0.8 mg/mL時(shí)，復(fù)合物穩(wěn)定性大于80%，復(fù)合物得到較大程度的保存。適當(dāng)提高復(fù)合物攝入量，對(duì)于其在胃液中的穩(wěn)定性有積極的影響。

圖4 體外模擬腸液中復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響Fig.4 Time-dependent effect of the concentration of the complex on its stability in SIF in vitro

由圖4可知，體外模擬腸液中復(fù)合物質(zhì)量濃度變化對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響顯著。隨著孵育時(shí)間的變化，復(fù)合物逐漸解離，穩(wěn)定性逐漸降低；隨著復(fù)合物質(zhì)量濃度增加，復(fù)合物穩(wěn)定性逐漸增大。如在30 min時(shí)，質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)復(fù)合物穩(wěn)定性變化量是質(zhì)量濃度是1.0 mg/mL時(shí)復(fù)合物變化量的3.79倍；在180 min時(shí)，前者是后者的4.04倍。說明復(fù)合物的穩(wěn)定性隨著復(fù)合物質(zhì)量濃度增大而增大。此外，同模擬胃液中相似，復(fù)合物質(zhì)量濃度高于0.8 mg/mL時(shí)，復(fù)合物穩(wěn)定性大于80%，復(fù)合物得到較大程度的保留，故適當(dāng)提高復(fù)合物攝入量，對(duì)于其在腸液中的穩(wěn)定性有積極的影響。

3 結(jié) 論

通過對(duì)復(fù)合物在體外模擬胃腸液中的穩(wěn)定性進(jìn)行研究。得出以下結(jié)論：1）pH值對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響：在模擬胃液和腸液中，隨pH值的升高，復(fù)合物穩(wěn)定性逐漸降低。在孵育前期，復(fù)合物穩(wěn)定性變化最顯著，孵育前30 min，穩(wěn)定性變化量均超過總變化量的50%以上。對(duì)比模擬胃液和模擬腸液，模擬胃液對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性影響大于模擬腸液。2）復(fù)合物質(zhì)量濃度對(duì)復(fù)合物穩(wěn)定性的影響：在模擬胃液和腸液中，隨復(fù)合物質(zhì)量濃度的升高，復(fù)合物穩(wěn)定性逐漸增大。復(fù)合物質(zhì)量濃度高于0.8 mg/mL時(shí)，復(fù)合物穩(wěn)定性在孵育時(shí)間內(nèi)均可達(dá)到80%，復(fù)合物質(zhì)量濃度的提高，使得其在模擬胃腸液中的穩(wěn)定性提高。研究表明在模擬胃腸液中pH值和復(fù)合物質(zhì)量濃度是影響復(fù)合物穩(wěn)定性的重要因素，這為將來研探討β-葡聚糖-EGCG復(fù)合物的體內(nèi)生物學(xué)作用提供一定的參考。

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in vitro Stability of the Complex of EGCG and Oat β-Glucan in Simulated Gastrointestinaltract Fluid

MA Ya-qin1, GAO Rui-ping1,2, LIU Jia1, ZHAO Guo-hua1,3,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China; 3. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Chongqing 400715, China)

In this study, the stability of epigallocatechin gallate (EGCG)-oat β-glucan complex in simulated gastric (SGF) and intestinal (SIF) fluids was investigated.The complex was prepared by vacuum freeze-drying method. The effect of different concentrations of EGCG-oat β-glucan complex and different pH levels of SGF and SIF on its stability was investigated. Results showed that the complex was more stable at lower pH levels in both SGF and SIF. It could be stabilized during fasting because food ingestion results in higher pH levels in the gastrointestinal fluid. This complex at higher concentrations had better stability in both SGF and SIF, reaching above 80% after being incubated for 180 min at 0.8 mg/L. This indicates that the stability of the complex in the gastrointestinal fluid can be improved by appropriately increasing its concentration.

oat β-glucan; EGCG; complex; simulated gastrointestinal fluid; stability

TS201.2

A

1002-6630（2014）03-0033-04

10.7506/spkx1002-6630-201403007

2013-01-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171654）

馬雅欽（1990—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c質(zhì)量控制。E-mail：mayaqin1990@126.com

*通信作者：趙國(guó)華（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)榉窍蕴妓衔锘瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)。E-mail：zhaoguohua1971@163.com