李勝華，伍賢進,*，曾軍英，張 儉，劉 峰

（1.懷化學院生命科學系，湖南 懷化 418008；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418008）

蛇含委陵菜總黃酮的體外和體內(nèi)降血糖效果研究

李勝華1,2，伍賢進1,2,*，曾軍英1,2，張 儉1,2，劉 峰1,2

（1.懷化學院生命科學系，湖南 懷化 418008；2.民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點實驗室，湖南 懷化 418008）

目的：探討蛇含委陵菜總黃酮（total f avonoid Potentilla kleiniana Wight et Arn.，TFP）的體外和體內(nèi)降血糖效果。方法：TFP是利用超聲波循環(huán)提取及D-101大孔樹脂純化得到。體外降血糖效果主要考察TFP對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶以及對氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorption capacity，ORAC）的抑制影響，體內(nèi)降血糖效果是利用鏈脲佐菌素誘導小鼠糖尿病模型，100、200、400mg/（kg·d）的不同劑量治療4周，每周末尾部動脈取血測定血糖，4周后眼眶取血測定血清胰島素，處死取肝臟測定肝糖原和丙酮酸激酶的含量。結(jié)果：體外降血糖效果發(fā)現(xiàn)，TFP對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制活性并且體現(xiàn)劑量依賴性，而對α-淀粉酶的抑制活性不高，對ORAC的抑制活性較高，而體內(nèi)降血糖效果發(fā)現(xiàn)，TFP不同劑量對糖尿病小鼠具有很好的降血糖效果，特別是400mg/（kg·d）的劑量組降血糖效果非常明顯，血清胰島素的含量得到明顯提高，另發(fā)現(xiàn)，TFP有利于丙酮酸激酶的分泌，從而促使肝糖原的合成，使得肝糖原的含量經(jīng)過治療后含量增加。結(jié)論：蛇含委陵菜總黃酮是一種具有很大潛力的降血糖和抗氧化的天然產(chǎn)物。

蛇含委陵菜；總黃酮；降血糖；體外；體內(nèi)

糖尿病（diabetes mellitus，DM）及其并發(fā)癥是威脅人類健康的主要疾病之一，是常見病、多發(fā)病，發(fā)病率和致殘率均較高，而且隨著全球老齡化趨勢的加劇，糖尿病的發(fā)病率將逐年上升，其死亡率在各種疾病中居第3位，而在糖尿病引起的死亡中，糖尿病并發(fā)癥引起的病人死亡占70%以上[1]，植物提取物降血糖的研究已經(jīng)得到國內(nèi)外研究機構(gòu)證實[2-3]，蛇含委陵菜（Potentilla kleiniana Wight et Arn.）屬于薔薇科委陵菜屬植物[4]，具有廣泛的生物活性，具有抗瘧疾、咳嗽、白痢、降血糖、抗病毒和抗炎作用[5-8]。主要成分包括萜類物質(zhì)、甾體類物質(zhì)以及黃酮（total flavonoid）和酚類物質(zhì)[9-10]。該植物在侗族地區(qū)采集全草食用有千年的歷史，常用于治療糖尿病，因此，本實驗進行了蛇含委陵菜總黃酮（total f avonoid Potentilla kleiniana Wight et Arn.，TFP）的體外和體內(nèi)降血糖及其機制研究，為蛇含委陵菜的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛇含委陵菜于2011年采自湖南洪江市，經(jīng)懷化學院劉光華老師鑒定為薔薇科委陵菜屬植物，憑證標本保存在懷化學院侗族藥用植物標本館內(nèi)。材料在40～50 ℃烘干粉碎。

阿卡波糖、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ） 美國Sigma 公司；鹽酸二甲雙胍 重慶科瑞制藥有限責任公司；其他試劑均為分析純。

1.2 動物

KM小鼠體質(zhì)量（22±2）g，購置于中南大學湘雅醫(yī)學院（合格證號：湘檢證字2008-0002）。在室溫下，相對濕度為50%的動物房中飼養(yǎng)。

1.3 儀器與設備

AL104電子天平 美國Mettler-Toledo儀器公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；CTXNW-10B超聲波循環(huán)提取機 北京弘祥生物技術(shù)開發(fā)公司；Free Style利舒坦雅培血糖儀 美國Abbott Diabetes Care公司；DU-800紫外掃描分光光度計 美國貝克曼庫爾特公司。

1.4 方法

1.4.1 TFP的提取

稱取干燥蛇含委陵菜2 kg，用70%乙醇浸泡24 h后利用循環(huán)式超聲波提取儀提取45min，減壓濃縮回收乙醇得水溶液，上D-101大孔樹脂，先用10%乙醇洗脫去除雜質(zhì)，在用60%的乙醇洗脫得總黃酮的乙醇溶液，減壓濃縮回收乙醇后烘干粉碎得TFP粉末。

1.4.2 蛇含委陵菜體外降血糖效果分析

1.4.2.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性測定

參照文獻[11]的測定方法，略作修改。分別取60 μL待測液（0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL樣品液、阿卡波糖溶液以及蘆丁溶液，同量的緩沖液作為空白對照）于96 孔酶標板中，加入50 μL α-葡萄糖苷酶溶液 （0.2 U/mL），振勻后于37 ℃水浴保溫10 min，加入50 μL 5.0mmol/L對硝基苯-β-D-葡萄糖醛酸苷 （4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）溶液振勻，在37 ℃水浴中反應20 min，加入160 μL Na2CO3溶液（0.2 mol/L）終止酶促反應，置于405 nm波長處測吸光度（A）。由于蛇含委陵菜黃酮本身有顏色，因此每個樣品需要測定背景吸收，并最終測定結(jié)果進行校正。每個樣品重復3 次取平均值。抑制率按式（1）計算。

式中：AS為樣品組吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.4.2.2 抑制α-淀粉酶活性測定

參照文獻[12]的測定方法，略作修改。取40 μL待測液（0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL樣品溶液、阿卡波糖溶液以及蘆丁溶液，以同體積的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）作為空白對照于25 mL比色管中，加入200 μL α-淀粉酶溶液（1.0 U/mL），在37℃水浴中使酶活化10 min，添加400 μL底物可溶性淀粉（1.0g/100mL）在25℃反應10 min，加入1.0 μL DNS（A液（12.0 g四水合酒石酸鉀鈉溶于 8.0 mL 2 mol/L NaOH）與B液（0.88 g的3,5-二硝基水楊酸溶于46 mL去離子水）體積比為1∶1）終止反應，進行沸水浴5 min，冷卻至室溫后加入10 mL蒸餾水以稀釋在540 nm 波長處測定吸光度。抑制率根據(jù)公式（1）計算。

1.4.3 抗氧化活性測定

氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorptioll capacity，ORAC）測定方法是目前體外抗氧化領(lǐng)域頗受關(guān)注的抗氧化能力方法，其方法參考文獻[13-14]進行，具體操作如下：依次在96 孔酶標板每個微孔中加入熒光素鈉溶液（終濃度63nmol/L）、磷酸鉀緩沖液（終濃度75 mmol/L，pH 7.4）、待測樣品（以75mmol/L磷酸鉀緩沖液配制）各20 mL，置于儀器中振蕩混勻10 s，37℃條件下預熱5 min后，加入2,2’-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽（2,2’-azobis（2-methylpropionamidine）dihydrochloride，AAPH）過氧化自由基發(fā)生物，終濃度12.8 mmol/L ）140 μL啟動反應，然后迅速將96 孔酶標板放入預置溫度為37 ℃的熒光分析儀內(nèi)，開始測定激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射波長為538 nm采用動力學方式，每2 min測定一個點，直至熒光衰減為零為止，反應設置未添加AAPH的熒光自然衰退變化和未添加抗氧化保護熒光衰退物質(zhì)的單純AAPH作為對照，以抗壞血酸為陽性對照藥，每個樣品重復3次采用近似積分法計算熒光衰退曲線下面積（area under the curve，AUC）。

實驗結(jié)果以抗氧化物質(zhì)的ORAC值表示：抗氧化劑存在下熒光衰退曲線下面積減去未添加抗氧化劑單純AAPH作用曲線下面積得到該樣品的保護面積（net AUC），抗氧化物質(zhì)的ORAC值即為抗氧化劑熒光衰退曲線的保護面積（net AUCTFP）與標準抗氧化物質(zhì)Trolox的保護面積（net AUCTrolox）的比值（若兩者濃度不同，應換算成相同濃度后再比較）因而ORAC值可以理解為Trolox當量。待測樣品的ORAC值就是以μmol Trolox當量/mg TFP表示。用公式（2）計算。

1.4.4 TFP體內(nèi)降血糖效果檢測

100 只KM小鼠禁食12 h后，注射鏈脲佐菌素150 mg/kg（用pH 4.5的檸檬酸鈉溶液配制成），72 h后，尾部動脈取血測定血糖含量，血糖含量大于11.1 mmol/L為造模成功的小鼠[15]。

選取造膜成功的小鼠60 只，隨機分為6 組，正常組（蒸餾水），模型組（鏈脲佐菌素組），二甲雙胍組，以及TFP低、中、高劑量組，劑量分別為100、200、400 mg/（kg·d），小鼠分籠飼養(yǎng)，每天按劑量給藥1 次，自由進食、飲水。實驗周期4周，在實驗1、2、3、4 周末尾靜脈采血，測空腹血糖。實驗第4周末，小鼠禁食5 h，一次性喂養(yǎng)葡萄糖3.0 g/kg，20 min后尾靜脈采血測定給葡萄糖后0、0.5、1、2 h的血糖值，進行糖耐量實驗并計算血糖曲線下面積。實驗末，小鼠股動脈采血，測定血清胰島素水平。脫臼處死，取肝臟立刻置于冰浴，并用生理鹽水清洗、濾紙拭干，稱取適量，用冰生理鹽水制成質(zhì)量濃度為10 g/100 mL肝勻漿，供肝糖原含量和丙酮酸激酶含量測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用方差分析和t檢驗，所有數(shù)據(jù)都以±s表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 TFP對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性的抑制

由圖1A可見，隨著TFP質(zhì)量濃度的增加，對α-葡萄糖苷酶的抑制活性也隨之上升，至0.8 mg/mL時達到最高，說明TFP對α-葡萄糖苷酶的抑制活性是劑量依賴型的。比較不同質(zhì)量濃度TFP、阿卡波糖和蘆丁對α-葡萄糖苷酶抑制活性可看出，隨質(zhì)量濃度增加，TFP對α-葡萄糖苷酶抑制活性的上升速度快于蘆丁，但稍慢于阿卡波糖。由圖1B可知，雖然隨著TFP質(zhì)量濃度的增加，對α-淀粉酶的抑制活性也隨之上升，但是抑制率卻遠低于阿卡波糖的抑制率，近似于蘆丁的抑制率。綜合圖1可得知，TFP是一種較強的α-葡萄糖苷酶抑制劑和較弱的α-淀粉酶抑制劑，并且顯示明顯的劑量依賴性。

圖 1TFPα-葡萄糖苷酶（AA）和α-淀粉酶（B）活性的抑制Fig.1 Inhibitory effect of TFP on the activity of α-glucosidase (A) and α-amylase (B)

2.2 不同質(zhì)量濃度TFP的ORAC值

圖2 不同質(zhì)量濃度TFP的ORAC值Fig.2 ORAC values of TFP at different concentrations

由圖2可知，蛇含委陵菜中的總黃酮具有較強的抗氧化性，任何類型的糖尿病都與抗氧化酶系統(tǒng)存在復雜的相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，很多植物提取物能夠明顯降低血糖的同時表現(xiàn)出很強的抗氧化性[16]，本研究中，蛇含委陵菜具有明顯的抑制α-葡萄糖苷酶的活性的同時具有較強的抗氧化性，說明是一種潛在的降血糖植物。

2.3 TFP體內(nèi)降血糖效果

2.3.1 TFP對糖尿病小鼠血糖值的影響由表1可知，糖尿病小鼠的血糖含量明顯高于正常組小鼠的血糖含量，在整個治療過程中，糖尿病小鼠的血糖含量明顯增加，經(jīng)過4 周的治療后發(fā)現(xiàn)，模型組糖尿病小鼠的血糖含量是正常小鼠的5.3 倍（P＜0.001），經(jīng)過不同劑量蛇含委陵采總黃酮的治療發(fā)現(xiàn)，治療過后的糖尿病小鼠的血糖含量顯著降低，各劑量組糖尿病小鼠的血糖含量與未經(jīng)治療的糖尿病小鼠相比降低顯著（P＜0.05），且400 mg/（kg·d）劑量組小鼠的血糖含量跟二甲雙胍組小鼠的血糖含量在4 周后比較相近，結(jié)果說明蛇含委陵采總黃酮具有較強的降血糖效果，并且體現(xiàn)為劑量依賴性。

表1 TFP對糖尿病小鼠血糖含量的影響Table1 Effect of TFP on blood glucose levels in STZ-induced diabetic mice

2.3.2 TFP對糖尿病小鼠糖耐量的影響

表2 TFP對糖尿病小鼠糖耐量的影響Table2 Effect of TFP on glucose tolerance test in diabetic mice

由表2可知，TFP 3個劑量組小鼠血糖曲線下面積均低于模型組，且TFP中、高劑量組差異非常顯著（P＜0.01）。表明TFP具有明顯降低糖尿病小鼠血糖曲線下面積的作用。

2.3.3 TFP對糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響

圖3 TFP對糖尿病小鼠血清胰島素含量的影響Fig.3 Effect of TFP on serum insulin levels in diabetic mice

由圖3可知，糖尿病小鼠的血清胰島素明顯減少，僅為正常小鼠血清胰島素含量的43%，經(jīng)過4周的二甲雙胍和TFP的治療后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與糖尿病小鼠血清胰島素含量比較，二甲雙胍和TFP劑量組小鼠血清胰島素含量都有明顯的變化，都明顯高于糖尿病小鼠的血清胰島素含量，特別是400mg/（kg·d）劑量組小鼠血清胰島素的含量與糖尿病小鼠血清胰島素含量相比，增加了68%。

2.3.4 TFP對糖尿病小鼠肝糖原含量的影響

在糖尿病小鼠中，肝糖原含量的減少原因主要是因為胰島素含量的缺少和肝糖原的合成受抑制造成，由圖4可知，經(jīng)過4周的蛇含委陵菜和二甲雙胍的治療后，胰島素的含量顯著增加，伴隨肝糖原含量的增加，與模型組相比較，正常組小鼠肝糖原的含量是糖尿病小鼠肝糖原含量的7.3 倍，TFP 3 個劑量組小鼠肝糖原含量分別是糖尿病小鼠肝糖原的1.5、2.3、4.7 倍，說明蛇含委陵菜可以從促進肝糖原的合成。

圖4 TFP對糖尿病小鼠肝糖原含量的影響Fig.4 Effect of TFP on liver glycogen levels in diabetic mice

2.3.5 TFP對糖尿病小鼠肝丙酮酸激酶含量的影響

圖5 TFP對糖尿病小鼠肝丙酮酸激酶的影響Fig.5 Effect of TFP on liver PK in diabetic mice

丙酮酸激酶是血糖和肝糖原相互轉(zhuǎn)化合成的關(guān)鍵酶，由圖5可知，在糖尿病小鼠中，丙酮酸激酶分泌減少，抑制血糖向肝糖原合成，所以糖尿病小鼠體現(xiàn)出高血糖而低肝糖原，經(jīng)過TFP的4周治療，丙酮酸激酶的含量明顯增加，促進血糖向肝糖原轉(zhuǎn)化，有利于糖尿病小鼠的血糖降低，這說明TFP能夠促進丙酮酸激酶的分泌和肝糖原的合成。

3 討 論

餐后血糖高的原因是在小腸內(nèi)葡萄糖迅速吸收的結(jié)果，其中各種α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶扮演重要的角色，它們可以促進淀粉和低聚糖等迅速水解成葡萄糖[17]，TFP對α-葡萄糖苷酶具有較強的抑制作用，使淀粉類分解為葡萄糖的速度減慢，從而減緩腸道內(nèi)葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。

氧化應激是造成胰腺β-細胞損傷和胰島素分泌受阻的重要原因，抗氧化劑可以防止胰腺β-細胞功能損傷和減少這種現(xiàn)象在糖尿病中頻繁出現(xiàn)[18]。近年來，很多研究都熱衷植物化學藥在治療糖尿病的同時特別注意其抗氧化作用。尤其是黃酮類化合物，有報道，黃酮類物質(zhì)在抑制α-葡萄糖苷酶、α-葡淀粉酶的同時還具有抗氧化活性[19]，通過對ORAC值的測定，表明蛇含委陵菜中總黃酮具有明顯的抗氧化活性。

糖尿病小鼠經(jīng)過蛇含委陵菜中總黃酮4周治療后，小鼠中血糖含量明顯減低，可能是蛇含委陵菜中黃酮刺激受損胰腺β-細胞的修復和刺激胰腺β-細胞大量分泌胰島素。肝糖原的含量與胰島素有非常密切的關(guān)系，這是因為胰島素能夠刺激肝糖原的合成和抑制肝糖原磷酸化酶[20]，促進肝糖原的沉積。丙酮酸激酶是肝糖原與血糖轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶，蛇含委陵菜中總黃酮促進肝丙酮酸激酶的分泌，從而使得血糖向肝糖原的合成，有利于血糖的降低。

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Antihyperglycemic Effect of Total Flavonoids from Potentilla kleiniana Wight et Arn. in vitro and in vivo

LI Sheng-hua1,2, WU Xian-jin1,2,*, ZENG Jun-ying1,2, ZHANG Jian1,2, LIU Feng1,2
(1. Department of Life Sciences, Huaihua University, Huaihua 418008, China; 2. Key Laboratory of Hunan Province for Study and Utilization of Ethnic Medicinal Plant Resources, Huaihua 418008, China)

Objective: To explore the hypoglycemic effect of total flavonoids from Potentilla kleiniana Wight et Arn. (TFP) in vitro and in vivo. Methods: TFP was purified by cyclic ultrasonic extraction and D-101 macroporous resin adsorption. in vitro tests were carried out to assess the inhibitory effect on α-glucosidase and α-amylase and oxygen radical absorption capacity (ORAC) of TFP. The in vivo antihyperglycemic effect was investigated by administration of streptozotocininduced diabetic mouse model at 100, 200 and 400 mg/(kg·d) body weight for 4 consecutive weeks. The venous blood glucose was measured at the end of each week. After four weeks, the insulin level in orbital blood serum was measured and all the animals were sacrificed for the determination of liver glycogen and pyruvate kinase (PK). Results: The inhibitory activity of TFP on α-glucosidase was strong in a dose-dependent manner, while the inhibitory activity on α-amylase was not strong. TFP had a strong ORAC activity. It exhibited a good hypoglycemic effect in diabetic mice at each dose and this effect was particularly noticeable at 400 mg/(kg·d) body weight. The serum insulin level was significantly increased and the secretion of pyruvate kinase was greatly enhanced, thus contributing to glycogen synthesis and increasing glycogen content after treatment. Conclusion: Potentilla kleiniana Wight et Arn. is a natural herb with potential hypoglycemic and antioxidant activities.

Potentilla kleiniana Wight et Arn.; total flavoids; antihyperglycemic effect; in vitro; in vivo

Q291

A

1002-6630（2014）11-0246-05

10.7506/spkx1002-6630-201411049

2013-05-29

湖南省科技計劃項目（2010FJ4115）；湖南省教育廳科技創(chuàng)新平臺項目（09K105）

李勝華（1978—），男，講師，碩士，主要從事生物活性成分的檢測與分離研究。E-mail：lishenghua110@126.com

*通信作者：伍賢進（1964—），男，教授，博士，主要從事藥用植物栽培研究。E-mail：hhuxianjin@163.com