石 嶺，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，陳麗麗，溫慧芳

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

響應(yīng)面法優(yōu)化堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)

石 嶺，趙 利*，袁美蘭，蘇 偉，劉 華，陳麗麗，溫慧芳

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，國家淡水魚加工技術(shù)研發(fā)分中心（南昌），江西 南昌 330013）

用Alcalase堿性蛋白酶對草魚蛋白質(zhì)進行酶解，比較酶的添加量、pH值、溫度、料液比以及酶解時間對草魚蛋白水解進程的影響，通過響應(yīng)面法優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的工藝條件。結(jié)果表明：Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白質(zhì)的最優(yōu)工藝條件為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0、料液比1∶15、酶解時間180 min，此條件下蛋白質(zhì)水解度達到23.46%。

草魚蛋白；酶解；響應(yīng)面

我國是世界漁業(yè)大國，淡水魚產(chǎn)量已經(jīng)連續(xù)20年居世界第一。近年來隨著我國淡水魚產(chǎn)品出口量逐年增加，淡水養(yǎng)殖的發(fā)展空間更加廣闊。但同時淡水魚產(chǎn)品中還存在著加工利用率低，低附加值產(chǎn)品多，深加工產(chǎn)品少等現(xiàn)象。魚蛋白質(zhì)經(jīng)酶解后得到的水解物，其溶解性、乳化性、起泡性和流變性等物理特性得到明顯改善[1-2]，且水解液中氨基酸種類齊全[3]，礦物質(zhì)含量豐富，其中不同長度的肽段具有促進氨基酸、礦物質(zhì)元素的吸收[4-5]、調(diào)節(jié)脂肪代謝[6-7]、降血壓[8-12]、抗疲勞[13-14]和抗氧化[15-20]等生理功能。本研究采用Alcalase堿性蛋白酶水解草魚蛋白，通過Box-Behnken試驗以及響應(yīng)面分析，優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的條件，為淡水魚資源的精深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚 樂買佳超市；Alcalase堿性蛋白酶(200000U/mL)諾維信生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

微波耦合酶反應(yīng)器 江南大學(xué)；JJ-2高速組織搗碎機 上海標(biāo)本模型廠；TDL-5A離心機 上海菲恰爾分析儀器有限公司；DELTA-320 pH計 美國梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 草魚魚肉成分的測定

水分含量：GB 5009.3—2010《食品中水分的測定》；蛋白質(zhì)含量：GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測定》；灰分：GB 5009.4—2010《食品中灰分的測定》；脂肪含量：GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》。

1.3.2 草魚蛋白的酶解工藝流程

新鮮魚→宰殺→清洗→采肉→絞碎→取肉→調(diào)節(jié)溫度和pH值→加酶水解→滅酶→離心取上清液→噴霧干燥

1.3.3 草魚蛋白質(zhì)酶解

1.3.3.1 料液比對蛋白質(zhì)水解進程的影響

稱取魚肉180、225、300、450、900 g，分別加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中，即固液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5，攪拌混勻，調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃，用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 8.5，待底物溫度上升至設(shè)定溫度，加入魚肉蛋白質(zhì)質(zhì)量3%的Alcalase堿性蛋白酶進行反應(yīng)，反應(yīng)過程中用1 mol/L氫氧化鈉溶液恒定體系pH值。酶解3 h后95 ℃滅酶5 min，離心取上清液，每個水平分別重復(fù)3次。

1.3.3.2 pH值對蛋白質(zhì)水解進程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃，同時調(diào)節(jié)體系pH值，分別使底物在pH值為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5條件下酶解，其余條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.3 溫度對蛋白質(zhì)水解進程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)體系pH值為8.5，調(diào)節(jié)水浴溫度分別為45、50、55、60、65 ℃；其余條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.4 加酶量對蛋白質(zhì)水解進程的影響

分別稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)體系pH值為8.5，調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃；向底物中分別加入質(zhì)量分數(shù)0.5%、1%、1.5%、2%、3%、6%的Alcalase堿性蛋白酶，其余條件同1.3.3.1節(jié)。

1.3.3.5 酶解時間對蛋白質(zhì)水解進程的影響

稱取魚肉300 g，加入4 500 mL水于酶反應(yīng)器中。調(diào)節(jié)體系pH值為8.5，調(diào)節(jié)水浴溫度為55 ℃；向底物中加入蛋白質(zhì)質(zhì)量1% Alcalase堿性蛋白酶，反應(yīng)過程中用1 mol/L氫氧化鈉溶液恒定體系pH值。當(dāng)反應(yīng)體系的pH值幾乎不再改變時，停止反應(yīng)，95 ℃滅酶5 min，離心取上清液。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

應(yīng)用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，在單因素試驗確定的最佳試驗因素水平的基礎(chǔ)上進行響應(yīng)面試驗，采用Design Expert v7.1.6軟件對試驗結(jié)果進行優(yōu)化以及結(jié)果分析。

1.3.5 水解度的測定

水解度(degree of hydrolysis，DH)的計算采用pH-state 法并參照袁斌等[21]的方法。

式中：h為每克蛋白質(zhì)水解肽鍵的物質(zhì)的量/mmol；V為所消耗的NaOH體積/mL；Nb為NaOH的濃度/(mmol/mL)；mp為底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量/g；htot為每克蛋白質(zhì)中肽鍵的物質(zhì)的量/mmol，對草魚蛋白而言，該值取8.6 mmol[22]；α為氨基的平均解離度。

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚魚肉基礎(chǔ)成分

表1 草魚魚肉的化學(xué)成分Table 1 Chemical composition of grass carp meat

草魚魚肉的基礎(chǔ)成分如表1所示，以干質(zhì)量計，草魚魚肉蛋白質(zhì)含量為86.86%、脂肪含量為5.22%，草魚魚肉蛋白質(zhì)含量高脂肪含量低，是一種優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)資源。

2.2 Alcalase堿性蛋白酶水解單因素試驗

2.2.1 料液比對水解度的影響

圖1 料液比對水解度的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on degree of hydrolysis

由圖1可知，隨著底物添加量的減小，水解度總體呈下降趨勢。因為底物添加量較低時酶與底物結(jié)合的幾率較小，故水解度會降低。增大底物添加量時水解度會相應(yīng)的提高；但當(dāng)?shù)孜锾砑恿窟^大時蛋白溶液的黏度又會增大，使得流動性變差，不利于操作。因此最終選擇料液比為1∶15較為適宜。

2.2.2 pH值對水解度的影響

圖2 pH值對水解度的影響Fig.2 Effect of pH on degree of hydrolysis

由圖2可知，隨著pH值的增加，水解度呈上升趨勢；當(dāng)pH值超過8.5時，水解度上升比較緩慢，這是因為Alcalase堿性蛋白酶對堿性環(huán)境有較強的適應(yīng)性，所以溶液的pH值升高，水解度也會相應(yīng)的提高。但是由于溶液堿性越大，反應(yīng)后中和水解液時產(chǎn)生的鹽就越多，這將給后續(xù)的處理帶來不便，所以選pH 8.5作為最優(yōu)條件。

圖3 溫度對水解度的影響Fig.3 Effect of temperature on degree of hydrolysis

2.2.3 溫度對水解度的影響由圖3可以看出，當(dāng)溫度在45～55 ℃時，水解度隨著溫度的升高而增加；當(dāng)溫度達到55 ℃時，水解度達到最大值25.02%；當(dāng)溫度超過55 ℃時，水解度開始下降。溫度升高可以提高酶的活性，且有利于底物折疊結(jié)構(gòu)的展開；當(dāng)溫度繼續(xù)升高，超過了酶的最適宜溫度時，酶逐漸失活，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解度下降[23]。

2.2.4 蛋白酶添加量對水解度的影響

圖4 加酶量對水解度的影響Fig.4 Effect of enzyme/substrate ratio on degree of hydrolysis

由圖4可知，蛋白質(zhì)的水解度會隨著Alcalase堿性蛋白酶添加量(質(zhì)量分數(shù))的增多而增大，但當(dāng)Alcalase堿性蛋白酶的添加量超過蛋白質(zhì)質(zhì)量的2%時，水解度的增加曲線趨于平緩，所以選擇2%為最優(yōu)條件。又由于在工業(yè)生產(chǎn)中出于成本核算的考慮，酶用量一般不超過2%，故后續(xù)實驗中堿性蛋白酶添加量以2%為上限。

2.2.5 酶解時間對水解度的影響

圖5 酶解時間酶解對水解度的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on degree of hydrolysis

由圖5可知，水解度會隨著酶解時間的延長而增大，水解曲線呈先快速上升后緩慢上升的的趨勢，當(dāng)時間達到180 min時，蛋白酶基本和蛋白質(zhì)完全作用，繼續(xù)水解底物濃度會繼續(xù)減小，隨著水解的進行酶的特異性催化位點減少，即水解過程中酶逐漸失活[24]。同時產(chǎn)生的多肽會與草魚蛋白競爭作為Alcalase堿性蛋白酶的反應(yīng)底物，從而進一步抑制蛋白酶的水解作用[25]?？紤]到隨著酶解時間的延長成本會增加，所以選擇180 min作為最佳條件。

2.3 Alcalase堿性蛋白酶酶解反應(yīng)的響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇對草魚蛋白水解度影響較大的3個因素：pH值（A）、溫度（B）、加酶量（C）為考察對象，以水解度DH（Y）為指標(biāo)，采用Design Expert v 7.1.6軟件進行響應(yīng)面試驗。試驗的因素水平如表2所示。

表2 Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白響應(yīng)面試驗因素水平表Table 2 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

表3 Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

表4 響應(yīng)面二次模型方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression model

圖6 各因素及交匯作用對水解度的影響Fig.6 Response surface plots for the effects of factors and their interactions on degree of hydrolysis

通過統(tǒng)計分析軟件Design Expert v 7.1.6進行數(shù)據(jù)分析，建立二次響應(yīng)面回歸模型為：DH＝21.38＋2.02A＋0.43B＋1.67C－0.87AB＋0.027AC＋0.66BC－0.31A2－0.91B2－1.34C2，回歸分析與方差分析結(jié)果見表3，交互作用的響應(yīng)面分析見圖6。由表4可知，方程因變量與自變量之間的線性關(guān)系明顯，該模型回歸顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著，且該模型說明該模型與實驗擬合良好，自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，可用于該反應(yīng)的理論推測。在此基礎(chǔ)上優(yōu)化Alcalase堿性蛋白酶最佳酶解條件參數(shù)為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0，預(yù)測水解度為23.62%，在此條件下酶解180 min，蛋白水解度為23.46%。所以說明響應(yīng)面的實驗值與回歸方程預(yù)測值基本吻合，建立的模型可以對實際工藝進行預(yù)測。

3 結(jié) 論

以水解度為指標(biāo)，通過單因素試驗確定Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的料液比、pH值、溫度、加酶量的最適范圍。采用Design Expert v7.1.6軟件，通過Box-Behnken試驗得到水解度與p H值（A）、溫度（B）、加酶量（C）關(guān)系的回歸模型，回歸方程為：DH＝21.38＋2.02A＋0.43B＋1.67C－0.87AB＋0.027AC＋0.66BC－0.31A2－0.91B2－1.34C2。Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白的最佳酶解工藝為：加酶量1.8%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 9.0、料液比1∶15、酶解時間180 min，蛋白質(zhì)水解度達到23.46%。本實驗采用Alcalase堿性蛋白酶酶解草魚蛋白，研究了響應(yīng)面優(yōu)化酶解工藝，而酶解產(chǎn)生的多肽的分離純化以及結(jié)構(gòu)功能仍有待進一步的研究。

[1] KLOMPONG V, BENJAKUL S, KANTACHOTE D, et al. Antioxidative activity and functional properties of protein hydrolysate of yellow stripe trevally (Selaroides leptolepis) as influenced by the degree of hydrolysis and enzyme type[J]. Food Chemistry, 2007, 102: 1317-1327.

[2] RAHALI V, CHOBERT J M, HTERTLE T, et al. Emusification of chemical and enzymatic hydrolysates of β-lactogobulin: characterization of the peptides adsorbed at the interface[J]. Nahrung, 2000, 44(2): 89-95.

[3] 王新星, 孔凡華, 許團輝, 等. 水解魚蛋白營養(yǎng)組成及評價[J]. 漁業(yè)科學(xué)進展, 2011, 32(3): 104-110.

[4] NESSE K O, NAGALAKSHMI A P, MARIMUTHU P, et al. Efficacy of a fish protein hydrolysate in malnourished children[J]. Indian Journal of Clinical Bio-chemistry, 2011, 26(4): 360-365.

[5] ZAMBONINO INFANTE J L, CAHU C L, PERES A, et al. Partial substitution of di-and tripeptides for native proteins in sea bass diets improves Dicentrarchus labrax larval development[J]. The Journal of Nutrition, 1997, 127: 608-614.

[6] 夏松養(yǎng), 鄧尚貴, 謝超, 等. 鳀魚(Engraulis japonicus)蛋白水解物的營養(yǎng)成分及抗高血脂作用的研究[J]. 海洋與湖沼, 2008, 39(4): 368-373.

[7] SAITO M, KIYOSE C, HIGUCHI T, et al. Effect of collagen hydrolysates from salmon and trout skins on the lipid profile in rats[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57: 10477-10482.

[8] CMOELLY V D V, HARRY G, DRIES B A, el al. Optimisation of the angiotensin converting enzyme inhibition by whey protein hydrolysates using response surface methodology[J]. International Dairy Journal, 2002, 12: 813-820.

[9] 陶以嘉, 徐大立, 王燎, 等. 高血壓研究進展[J]. 心血管病學(xué)進展, 2004(增刊1): 118-123.

[10] 封梅. 酶解草魚制備降血壓肽的研究[D]. 武漢: 武漢工業(yè)學(xué)院, 2008.

[11] SUETSUNA K, OSAJIMA K. The inhibitory activities against angiotensin Ⅰ-converting enzyme of basic peptides originating from sardine and hair tail meat[J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 1986, 52: 1981-1984.

[12] BYUN H G, KIM S K. Purification and characterization of angiotensinⅠconverting enzyme (ACE) inhibitory peptides from Alaska Pollack (Theragra chalcogramma) skin[J]. Process Biochemistry, 2001, 36: 1155-1162.

[13] 趙玉紅, 孔保華, 張立鋼. 魚肽的抗疲勞功能研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2005, 36(4): 490-493.

[14] ADLER N J. Enzymic hydrolysis of food protein[M]. London: Elsevier, 1986: 10-11.

[15] 任嬌艷. 草魚蛋白源抗疲勞生物活性肽的制備分離及鑒定技術(shù)研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2008.

[16] LI Li, WANG Jinshui, ZHAO Mouming, et al. Artificial neural networks for production of antioxidant peptides derived from big head carp with Alcalase[J]. Food Technology Biotechnology, 2006, 44(3): 441-448.

[17] 李琳. 鳙魚蛋白控制酶解及酶解物抗氧化研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2006.

[18] SHIMONOSEK I. Separation and identification of antioxidant peptide from proteolytre digest of dried bonito[J]. Bulletin of the Japanese Society of Scientific Fisheries, 65(1): 92-96.

[19] KIM S, JE J, KIM S. Purification and characterization of antioxidant peptide from hoki (Johnius belengerii) frame protein by gastrointestinal digestion[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry, 2006, 18(1): 31-38.

[20] JEON Y J, BYUN H G, KIM S K. Improvement of functional properties of cod frame protein hydrolysates using ultrafiltration membranes[J]. Process Biochemistry, 1999, 35: 471-478.

[21] 袁斌, 呂桂善, 劉小玲. 蛋白質(zhì)水解度的簡易測定方法[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué), 2002, 21(2): 113-115.

[22] 李雪, 羅永康, 尤娟. 草魚魚肉蛋白酶解物抗氧化性及功能特性研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 16(1): 94-99

[23] 左繼紅. 微波輔助蛋白酶水解反應(yīng)工藝和反應(yīng)器的研究[D]. 無錫:江南大學(xué), 2008.

[24] MULLALLY M M, O’CALLAGHAN D M, FITZGERALD R J, et al. Zymogen activation in pancreatic endoproteolytic preparations and influence on some whey protein hydro lysate characteristics[J]. Journal of Food Science, 1995, 60(2): 227-233.

[25] 林偉鋒. 可控酶解從海洋魚蛋白中制備生物活性肽的研究[D]. 廣州: 華南理工大學(xué), 2003.

Optimizing Conditions for Alcalase-Catalyzed Hydrolysis of Grass Carp Protein by Response Surface Methodology

SHI Ling, ZHAO Li*, YUAN Mei-lan, SU Wei, LIU Hua, CHEN Li-li, WEN Hui-fang
(National R&D Branch Center for Freshwater Fish Processing, College of Life Science, Jiangxi Science and Technology Normal University, Nanchang 330013, China)

This study aimed to optimize the conditions for enzymatic hydrolysis of grass carp proteins. Alcalase was used to hydrolyze grass carp proteins. The effects of enzyme/substrate ratio, pH value, temperature, material/liquid ratio and hydrolysis time on the degree of hydrolysis were analyzed. Box-Behnken design (BBD) and response surface methodology (RSM) were adopted to obtain the optimum hydrolysis conditions on the basis of results of single-factor experiments. The degree of hydrolysis of 23.46% was obtained under the optimum hydrolysis conditions of 1.8%, 55 ℃, 1:15, 180 min and 9.0 for enzyme/substrate ratio, temperature, material/liquid ratio, hydrolysis time, and pH, respectively.

grass carp protein; enzymatic hydrolysis; response surface methodology

TS254.4

A

1002-6630（2014）04-0026-04

10.7506/spkx1002-6630-201404006

2013-04-25

江西省高等學(xué)校科技落地計劃項目（KJLD12009）

石嶺（1989—），男，碩士研究生，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：839066518@qq.com

*通信作者：趙利（1967—），女，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)。E-mail：lizhao618@hotmail.com