冬雪

通過基因工程技術(shù)把外源性目標(biāo)基因?qū)肽撤N受體動物的生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和早期胚胎，并在其染色體上穩(wěn)定整合，之后經(jīng)過各種發(fā)育途徑把外源性基因傳遞到子代，這就是動物的轉(zhuǎn)基因，或稱轉(zhuǎn)基因動物。

外源性基因?qū)胧荏w動物有不同的方法，同時，由于有不同的受體動物，因此要根據(jù)實際情況采用不同的方法對動物進(jìn)行轉(zhuǎn)基因。大致而言，動物轉(zhuǎn)基因的方法有：逆轉(zhuǎn)錄病毒法、顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、精子載體法和體細(xì)胞核移植法（體細(xì)胞克隆介導(dǎo)法）等。

通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移基因

研究人員早就發(fā)現(xiàn)，逆轉(zhuǎn)錄病毒常常能侵入宿主細(xì)胞并整合于細(xì)胞中的DNA，因此逆轉(zhuǎn)錄病毒被用來當(dāng)成載體以進(jìn)行外源性基因的轉(zhuǎn)移。一般做法是，把外源性基因插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒，再由逆轉(zhuǎn)錄病毒感染受體動物的胚胎。此后將感染的桑椹期胚胎導(dǎo)入動物子宮，就可發(fā)育成攜帶外源性基因的子代動物。

具體的原理是，逆轉(zhuǎn)錄病毒的核酸在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下會反轉(zhuǎn)錄為雙鏈DNA，然后整合到受體細(xì)胞核基因組中。由于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA的長末端重復(fù)序列（LTR）區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄啟動子活性，如果把外源基因連接到LTR下部進(jìn)行重組后，包裝成高滴度病毒顆粒，加入到動物早期胚胎的培養(yǎng)液中，或與胚胎共同培養(yǎng)，或注入囊胚腔中，攜帶外源性基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA就可以整合到宿主染色體上，達(dá)到外源性基因轉(zhuǎn)移到受體動物胚胎的目的。

2001年，美國哥倫比亞大學(xué)的帕克等人利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將綠色熒光蛋白（EGFP）基因轉(zhuǎn)入豬的成纖維細(xì)胞和耳上皮細(xì)胞，然后用這些細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行核移植，獲得了能發(fā)出綠色熒光的轉(zhuǎn)基因豬。與此同時，其他研究人員利用這種方法培育出轉(zhuǎn)基因猴。

但是，逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體具有潛在的致癌性，而且載體的構(gòu)建較為復(fù)雜，容納外源性基因的大小也有限，因此這項技術(shù)的應(yīng)用受到一定限制。

顯微注射法轉(zhuǎn)移基因

動物轉(zhuǎn)基因的顯微注射法又稱受精卵原核顯微注射法，是用直徑約0.5～1微米的玻璃微管吸入外源性基因，直接插入到受體動物的受精卵的細(xì)胞內(nèi)，將外源性基因注入細(xì)胞中，然后通過受體動物基因組序列可能發(fā)生的重組、缺失、復(fù)制或易位等，使外源性基因嵌入受體動物的染色體內(nèi)，最后這樣的胚胎移植到代孕母體子宮內(nèi)并發(fā)育成子代個體。

1980年美國的戈登等人首先用顯微注射法創(chuàng)造了轉(zhuǎn)基因小鼠。他們把小鼠的受精卵取出來，在顯微鏡下將胸苷激酶基因用玻璃微管送入受精卵的細(xì)胞中，然后將受精卵輸入代孕母鼠的子宮內(nèi)，最終發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠。此后研究人員相繼把人的珠蛋白基因和胰島素基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)。

顯微注射法的優(yōu)點是，動物的任何外源性基因都可轉(zhuǎn)入受體動物體內(nèi)，而且用這種方法已經(jīng)獲得轉(zhuǎn)基因小鼠、魚、大鼠、兔子以及轉(zhuǎn)基因牛、羊、豬等。但是，這種方法轉(zhuǎn)移外源性基因到受體動物的染色體時是隨機整合的，因而難以控制其整合率。另外對外源性基因能否穩(wěn)定整合于受體基因組的檢測必須等到子代個體出生后才能進(jìn)行和確認(rèn)，不利于在生育期長、產(chǎn)仔少的大家畜中應(yīng)用。

胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法

胚胎干細(xì)胞（ES）是從哺乳動物囊胚期內(nèi)的細(xì)胞團(tuán)中分離出來的尚未分化的胚胎細(xì)胞，具有發(fā)育的多能性，能夠分化出各種組織。20世紀(jì)80年代中期研究人員就開始利用胚胎干細(xì)胞進(jìn)行動物轉(zhuǎn)基因。方法是，將外源性基因直接導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞，經(jīng)體外培養(yǎng)篩選后再注入到受體胚胎，與其中的胚胎細(xì)胞聚集在一起，成為受體胚胎的一部分，參與其分化。

此后，這種胚胎可發(fā)育成嵌合體的轉(zhuǎn)基因動物，這種動物體內(nèi)有一部分組織來源于整合有外源性基因的供體胚胎干細(xì)胞。在嵌合過程中，從胚胎干細(xì)胞分化而成的生殖細(xì)胞可通過雜交將轉(zhuǎn)入的外源性基因傳遞到子代。

研究證明，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法可使受體動物細(xì)胞中外源性基因整合率達(dá)50%，其中生殖細(xì)胞中外源性基因整合率可達(dá)30%。但是，建立胚胎干細(xì)胞系比較困難，現(xiàn)在只建立了小動物的胚胎干細(xì)胞系，豬、羊、牛等大型動物的胚胎干細(xì)胞系尚未建立。

精子載體法

早在1971年，研究人員就發(fā)現(xiàn)，外源性基因可以進(jìn)入動物精子。后來，研究人員將精子反復(fù)冷凍或經(jīng)化學(xué)物質(zhì)處理后與外源性基因共同孵育，使外源性基因與精子結(jié)合，通過人工授精獲得轉(zhuǎn)基因個體。

1989年，意大利研究人員拉維特拉諾將小鼠附睪精子與線粒體或環(huán)狀pSV2CAT質(zhì)粒一起在37℃下孵育30分鐘，再用這種精子對成熟卵子進(jìn)行體外授精，這樣得到胚胎移植入受體鼠的子宮孕育，通過受體鼠孕育產(chǎn)出250只小鼠，以CAT基因為標(biāo)記進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)有30%的小鼠成為轉(zhuǎn)基因鼠。

目前研究人員通過精子載體法已獲得了12種轉(zhuǎn)基因動物，如轉(zhuǎn)基因牛、豬、家兔和小鼠等。但是，這種方法進(jìn)行動物轉(zhuǎn)基因的成功率不高，效果也不穩(wěn)定，還有待進(jìn)一步研究和發(fā)展。其中，必須弄清楚精子和外源性基因結(jié)合的分子機制，外源性基因在精子和受精卵內(nèi)的復(fù)制機理，以及促進(jìn)精子結(jié)合外源性基因的方法和途徑。

體細(xì)胞核移植法

體細(xì)胞核移植法又稱體細(xì)胞克隆介導(dǎo)法，原理是，將外源性基因?qū)雱游矬w細(xì)胞染色體中，然后通過顯微操作技術(shù)將轉(zhuǎn)入了外源性基因的細(xì)胞核移植到去核的卵母細(xì)胞中構(gòu)成一個重建卵子，然后用人工方法讓這個卵子發(fā)育，形成胚胎，再把胚胎移植到受體動物中，經(jīng)妊娠、分娩后獲得轉(zhuǎn)基因克隆動物。

利用體細(xì)胞核移植法是目前動物轉(zhuǎn)基因中的高級技術(shù)，1997年世界上第一個轉(zhuǎn)基因綿羊（克隆羊）多利就是用這種方法產(chǎn)生的，是英國PPL公司與羅斯林研究所率先應(yīng)用體細(xì)胞核移植法獲得的成果。

多利誕生的過程和原理可以詳細(xì)解釋體細(xì)胞核移植法進(jìn)行的動物轉(zhuǎn)基因。

研究人員先從一只6歲的芬蘭多塞特雌性白面綿羊（簡稱A）的乳腺中取出乳腺細(xì)胞，將其放入低濃度的培養(yǎng)液中，細(xì)胞逐漸停止分裂，這個細(xì)胞稱為供體細(xì)胞。此后，研究人員從一頭蘇格蘭黑面雌性綿羊（簡稱B）的卵巢中取出未受精的卵子，并將細(xì)胞核去除，使這個卵子成為一個無細(xì)胞核的卵細(xì)胞，也稱為受體細(xì)胞。

然后，研究人員利用電脈沖方法讓供體細(xì)胞和受體細(xì)胞融合，在這個過程中A細(xì)胞的細(xì)胞核融入B細(xì)胞中并像受精卵一樣產(chǎn)生細(xì)胞分裂、分化，從而形成胚胎。最后將這個胚胎移植到另一只蘇格蘭黑面雌性綿羊（簡稱C）的子宮內(nèi)，胚胎正常發(fā)育，足月孕育后綿羊C娩出小綿羊多利。

從這個過程可以看出，多利的主要遺傳物（細(xì)胞核DNA）來自多塞特雌性白面綿羊（A），當(dāng)然，多利身上還有來自蘇格蘭黑面雌性綿羊（B）的線粒體DNA，因為B細(xì)胞盡管去除了細(xì)胞核，在其細(xì)胞質(zhì)中還有多種細(xì)胞器，其中就含有線粒體，線粒體也是一種遺傳物質(zhì)。所以，多利有3位母親，一是基因母親多塞特白面母綿羊（A）；第二個是借卵母親，也稱線粒體母親，即剔除了細(xì)胞核的蘇格蘭黑面綿羊（B），胚胎是在B的卵子中借殼融合、分裂、發(fā)育而成的；第三個是代孕母親，即另一頭蘇格蘭黑面雌性綿羊（C），多利是在綿羊C的子宮中孕育并分娩的。

從這個意義上看，這樣的轉(zhuǎn)基因?qū)嶋H上轉(zhuǎn)移了多塞特雌性白面綿羊（A）的全部細(xì)胞核的基因組。由于多利沒有父親，是通過無性繁殖即克隆而來，因此這樣的轉(zhuǎn)基因方法也稱為體細(xì)胞克隆介導(dǎo)法。

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