■方秋紅 侯永清 趙 迪 汪中興 王 蕾 易 丹 肖 航 陳振強(qiáng)

（武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢420023）

抗生素產(chǎn)生的抗藥性和藥物殘留問(wèn)題越來(lái)越引起人們的重視。尋找無(wú)公害、無(wú)殘留的綠色飼料添加劑已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。歐盟等國(guó)家在1999年就制定了法律來(lái)禁止使用抗生素促生長(zhǎng)劑，并在2006年全面禁止抗生素促生長(zhǎng)劑的使用。

植物精油是由植物高度濃縮提取的，作為一類植物提取物，具有多方面的功效，現(xiàn)已知道植物精油具有很好的抑菌性，對(duì)養(yǎng)殖生產(chǎn)中導(dǎo)致仔豬腹瀉的大腸桿菌和沙門氏菌有很好的抑制作用。肉桂油（Cinnamon oil）是植物精油的一種，是肉桂的提取物，主要成分為肉桂醛，含量占80%以上，通常采用水蒸汽法和超臨界CO2萃取法獲得，在食品，醫(yī)藥和飼料添加劑上有很廣泛的用途，由于其具有較好的抑菌和殺菌效果，在養(yǎng)殖業(yè)中有一些應(yīng)用。本試驗(yàn)旨在研究肉桂油的抑菌效果及對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能和血液生化指標(biāo)的影響，為肉桂油在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑

肉桂油、牛至油、百里香油、茶樹(shù)油、刃天青購(gòu)自Sigma公司，吐溫80購(gòu)自阿拉丁試劑公司。

1.1.2 供試菌種

豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（Escherichia Coli）K88和豬源霍亂沙門氏菌（Salmonella Typhimurium）A72由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備

NB液體培養(yǎng)基：酵母浸出物3 g，胰蛋白棟5 g，氯化鈉（NaCl）5 g，葡萄糖15 g，水1 000 ml。半固體培養(yǎng)基添加0.75%的瓊脂糖，固體培養(yǎng)基添加1.5%的瓊脂糖。

1.2.2 菌懸液的制備

將大腸桿菌和沙門氏菌經(jīng)37℃搖床活化后，制成菌懸液，采用涂平板技術(shù)測(cè)定菌懸液濃度，調(diào)制1×109cfu/ml備用。

1.2.3 植物精油的最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

通過(guò)刃天青結(jié)合微量肉湯稀釋法比較精油的最小抑菌濃度，挑選抑菌效果好的精油用0.22 μm的過(guò)濾器過(guò)濾除菌，再用經(jīng)滅菌處理的1%吐溫80的NB肉湯培養(yǎng)配制成濃度為12 800 mg/l的待測(cè)液原液。再將1×109cfu/ml的菌懸液梯度稀釋至5×105cfu/ml。在試管中采用2倍稀釋法將待測(cè)藥物稀釋成一系列濃度，即12 800、6 400、3 200、1 600、800、400、200 mg/l等，再對(duì)96孔板進(jìn)行編號(hào)，每孔加入0.25 g/l的刃天青2 μl，再按照由濃度低到濃度高的原則，從第一孔到第七孔依次加入350 μl稀釋好的藥物，同一濃度同一排做3個(gè)重復(fù)，另外再取3個(gè)孔只添加NB培養(yǎng)液做空白對(duì)照，3個(gè)孔只添加供試菌做陽(yáng)性對(duì)照，加好后將96孔板加蓋并用膠紙部分密封以減少培養(yǎng)過(guò)程中孔中水分蒸發(fā)，之后放入培養(yǎng)箱中，于37℃培養(yǎng)，12 h后觀察。加入刃天青的培養(yǎng)管以培養(yǎng)液顏色由藍(lán)色變?yōu)榉奂t色表示細(xì)菌生長(zhǎng)呈陽(yáng)性。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物和日糧

選用體重相近（平均體重5.02 kg的杜洛克×長(zhǎng)白×大約克夏三元雜交仔豬16頭，21日齡斷奶，隨機(jī)分成2個(gè)處理，每個(gè)處理8個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧，試驗(yàn)組飼喂添加了50 mg/kg的肉桂油日糧。預(yù)飼一周，正式試驗(yàn)期21 d。

試驗(yàn)日糧參照NRC（1998）生長(zhǎng)豬的營(yíng)養(yǎng)需要標(biāo)準(zhǔn)配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平

1.4 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)豬舍保持通風(fēng)良好，維持室溫在22～25℃；仔豬在不銹鋼代謝籠（代謝籠面積為1.0×1.5 m2，配備不銹鋼食槽）飼養(yǎng)，由鴨嘴式飲水器供水；每天在8:00、12:00、16:30、21:30飼喂粉料，保證自由采食，自由飲水；每天清掃豬舍一次，隔天進(jìn)行圈舍用苯扎溴銨消毒液消毒。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

分別于正式試驗(yàn)的第0、14和21 d清晨，對(duì)所有仔豬空腹稱重，仔細(xì)記錄每頭仔豬每天的采食量，計(jì)算每頭仔豬的平均日采食量（ADFI），平均日增重（ADG）和料肉比（F/G）。

1.5.2 腹瀉率

在正式試驗(yàn)期間，每天定時(shí)觀察并記錄豬的腹瀉情況（以糞便較稀，黏不成形），采集糞便含水量≥70%，視為腹瀉，按如下公式計(jì)算腹瀉率。

腹瀉率（%）=腹瀉頭數(shù)總和/（豬頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）×100。

1.5.3 血液生化指標(biāo)

血樣收集和處理：于試驗(yàn)第21 d，前腔靜脈用肝素鈉真空管和EDTA采血管分別采血，用來(lái)分離血漿和測(cè)定全血，用肝素鈉真空管采的血靜置15 min后離心（3 000 r/min，10 min）取上清得到血漿，分裝后置于-20℃冰箱冷凍保存，待測(cè)。

測(cè)定方法：紅細(xì)胞比容和血漿總蛋白、白蛋白、尿素氮、谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、甘油三酯、磷酸肌酸激酶、總膽固醇、氯、總膽紅素、血糖均送至武漢市醫(yī)藥工業(yè)研究院進(jìn)行測(cè)定；血漿谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活力（glutathione peroxidase，GSH-Px）采用比色法；血漿超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力采用羥胺法法；血漿髓過(guò)氧化物酶（MPO）采用比色法；丙二醛（MDA）采用微量酶標(biāo)儀法；一氧化氮合酶總型和分型（T-NOS和i-NOS）采用比色法；過(guò)氧化氫酶（CAT）采用鉬酸銨法，試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所第一分所，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)處理

對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，所得數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示”，用Duncan's法對(duì)各組間平均數(shù)進(jìn)行多重比較，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.1表示有顯著性趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油的最小抑菌濃度(見(jiàn)表2)

表2 植物精油的最小抑菌濃度（MIC）

由表2可以看出，肉桂油對(duì)兩種供氏菌有很強(qiáng)的抑菌能力，其最小抑菌濃度MIC為800 μl/l，牛至油、百里香油、茶樹(shù)油對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌的最小抑菌濃度不同，對(duì)大腸桿菌為1 600、3 200、6 400 μl/l，對(duì)沙門氏菌為800、1 600、3 200 μl/l，說(shuō)明肉桂油的抑菌效果最好。

2.2 肉桂油對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能的影響(見(jiàn)表3)

表3 肉桂油對(duì)斷奶仔豬生產(chǎn)性能及腹瀉率的影響

由表3可以看出，與對(duì)照組相比，精油組的平均日增重提高了12.47%，平均日采食量提高了7.16%，料肉比降低了5.13%，但三組數(shù)據(jù)都沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），這個(gè)結(jié)果與方熱軍等（2010）研究結(jié)果一致。另外，添加肉桂油后，對(duì)仔豬的腹瀉率沒(méi)有改變（P＞0.05），這可能由于對(duì)照組腹瀉率較低，肉桂油未能進(jìn)一步降低腹瀉率。

2.3 肉桂油對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響(見(jiàn)表4)

表4 肉桂油對(duì)斷奶仔豬血液生化指標(biāo)的影響

由表4可知，添加肉桂油后，仔豬的總蛋白和白蛋白有了明顯的升高，分別提高了10.06%(P＜0.05)和24.07%(P＜0.05)，血液紅細(xì)胞比容有提高趨勢(shì)(+11.74%，P=0.082)。

2.4 肉桂油對(duì)斷奶仔豬血漿抗氧化能力的影響（見(jiàn)表5）

由表5可以看出，添加肉桂油后，其血漿中一氧化氮合酶（總型）的含量顯著降低（P＜0.001），谷胱甘肽過(guò)氧化物酶比對(duì)照組升高了13.66%（P=0.085）。過(guò)氧化氫酶、髓過(guò)氧化氫酶、一氧化氮合酶（分型）和超氧化物歧化物酶各值差異均不顯著（P＞0.05）。

表5 肉桂油對(duì)斷奶仔豬血漿抗氧化能力的影響

3 討論

3.1 植物精油的抑菌能力

MIC（最小抑菌濃度）常用來(lái)定量測(cè)定體外抗菌活性。本試驗(yàn)中肉桂油的MIC最小，說(shuō)明肉桂油比其它受試的植物精油有較強(qiáng)的抑菌能力。顧仁勇等的試驗(yàn)也表明肉桂油對(duì)大腸桿菌等供試菌有較好的抑菌性。王文風(fēng)等探討了桂皮醛對(duì)122株厭氧菌的抗菌活性，結(jié)果表明，76%的試驗(yàn)菌株的MIC在128 μg/ml以下，96.7% 的試驗(yàn)菌株的MIC在256 μg/ml以下。

3.2 肉桂油對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能和腹瀉率的影響。

給仔豬飼喂50 mg/kg的肉桂油日糧，并未影響仔豬的生產(chǎn)性能。這與方熱軍等（2010）的研究報(bào)道一致，添加100 mg/kg的植物精油使仔豬的平均日增重提高5.04%（P＞0.05），平均日采食量提高3.0%（P＞0.05），料肉比降低1.9%（P＞0.05）。植物精油具有抑菌和殺菌作用，它隨日糧進(jìn)入動(dòng)物消化道后，可改善消化道內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)，優(yōu)化腸道中的微生態(tài)環(huán)境，保持腸道菌群平衡，從而減少腹瀉率的發(fā)生，試驗(yàn)結(jié)果可能由于對(duì)照組腹瀉率較低，添加肉桂油后仔豬的腹瀉率沒(méi)有改變（P＞0.05）。

3.3 肉桂油對(duì)仔豬血液生化指標(biāo)的影響

在反映動(dòng)物機(jī)體代謝和細(xì)胞通透性上，血液生化指標(biāo)具有重要的意義，總蛋白反映了日糧中的蛋白質(zhì)水平及動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)吸收代謝程度，總蛋白濃度高說(shuō)明動(dòng)物的蛋白質(zhì)合成代謝速度快，白蛋白屬于球蛋白的一種，血漿白蛋白占總蛋白的50%～60%，其功能主要是維持血管內(nèi)滲透壓(占血漿膠體滲透壓的75%)，并可形成結(jié)合蛋白進(jìn)行物質(zhì)運(yùn)輸，對(duì)脂類轉(zhuǎn)運(yùn)尤其重要。劉猛的試驗(yàn)表明，添加植物精油能顯著提高仔豬的總蛋白和白蛋白(P＜0.05)，本試驗(yàn)中添加50 mg/kg的肉桂油提高仔豬的總蛋白和白蛋白（P＜0.05），說(shuō)明添加肉桂油后可以改善仔豬的蛋白代謝狀況。紅細(xì)胞比容是指紅細(xì)胞在全血中所占的容積百分比，紅細(xì)胞是通過(guò)血液運(yùn)送氧氣的最主要的媒介，試驗(yàn)中添加肉桂油后仔豬的紅細(xì)胞比容升高11.74%（P=0.082），說(shuō)明肉桂油對(duì)提高紅細(xì)胞比容有一定的作用，其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.4 肉桂油對(duì)仔豬血漿抗氧化能力的影響

生物體呼吸過(guò)程中有2%的氧轉(zhuǎn)化為氧自由基，氧自由基非?；钴S，但過(guò)量的自由基會(huì)造成機(jī)體細(xì)胞和組織的損傷。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）是動(dòng)物機(jī)體一種重要的過(guò)氧化物酶，血漿中的谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與清除細(xì)胞外的過(guò)氧化氫和參與GSH的運(yùn)輸有關(guān)。MDA是各類氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸所形成的脂質(zhì)過(guò)氧化物，間接反映機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的程度。SOD在有機(jī)體氧化與抗氧化平衡中起至關(guān)重要的作用，SOD活力間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，其活性降低間接反映超氧陰離子自由基含量增高。髓過(guò)氧化物酶（MPO）是由中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些組織的巨噬細(xì)胞分泌的含血紅素輔基的血紅素蛋白酶，是血紅素過(guò)氧化物酶超家族成員之一，與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。過(guò)氧化氫酶（CAT）是催化過(guò)氧化氫分解成氧和水的酶，防止機(jī)體過(guò)氧化，不同的組織中其活性高低水平不同。一氧化氮合酶是一種同工酶，分別存在于內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、神經(jīng)吞噬細(xì)胞及神經(jīng)細(xì)胞中。在哺乳動(dòng)物中，高濃度NO具有抗腫瘤和病原體作用，低濃度時(shí)起信使分子的作用，具有調(diào)節(jié)血流、神經(jīng)傳導(dǎo)、包括學(xué)習(xí)、記憶在內(nèi)的多種生理功能，但濃度過(guò)高又會(huì)給機(jī)體造成損傷。本試驗(yàn)中，添加50 mg/kg的肉桂油后提高了仔豬血液谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的活性。說(shuō)明肉桂油可以在一定程度上提高機(jī)體抗氧化能力，其機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

肉桂油對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有很好的抑制作用（MIC=800 μl/l）。日糧中添加50 mg/kg的肉桂油改善仔豬的蛋白質(zhì)代謝狀況，提高紅細(xì)胞比容，并增強(qiáng)仔豬的抗氧化能力。

（參考文獻(xiàn)14篇，刊略，需者可函索）