■郭培紅 宋學(xué)宏 李 勇 周邦維 于學(xué)權(quán) 常欣堂

（1.貝瑞康生物科技有限公司,江蘇蘇州215123;2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院,江蘇蘇州215123;3.中國(guó)科學(xué)院海洋研究所,山東青島266071;4.天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司,天津300452）

卵黃抗體（IgY）又稱卵黃免疫球蛋白，是在特異性抗原刺激下由禽類B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生并轉(zhuǎn)移到卵黃中的多克隆抗體。卵黃抗體具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、特異性強(qiáng)、制備簡(jiǎn)單、成本低、綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，在食品、醫(yī)藥、生物品等方面得到了廣泛應(yīng)用[1-2]。然而，在國(guó)內(nèi)的研究報(bào)道中，大部分是以滅活的病毒、細(xì)菌、細(xì)胞等顆粒性抗原為免疫原制得的抗體[3-5]，在病因不明確的情況下特異性菌株或病毒的選擇成為制約性問(wèn)題,有很大的滯后性；且致病菌容易發(fā)生變異很可能會(huì)引起卵黃抗體的治療和預(yù)防效果下降，這在當(dāng)今畜禽養(yǎng)殖實(shí)踐中體現(xiàn)尤為明顯。因此，尋找引起水產(chǎn)動(dòng)物疾病發(fā)生的內(nèi)源性因子或活性物質(zhì)，并以此作為抗原生產(chǎn)卵黃抗體或復(fù)合制劑顯得尤為必要。

本試驗(yàn)所用抗腸炎功能蛋白，是利用免疫學(xué)和分子生物學(xué)手段篩選出的動(dòng)物腸道的關(guān)鍵炎癥因子，以其表達(dá)產(chǎn)物作為抗原免疫蛋雞產(chǎn)生的非特異性卵黃抗體，并經(jīng)微包膜、噴霧干燥而制得。將抗腸炎功能蛋白添加到點(diǎn)帶石斑魚膨化飼料中進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，通過(guò)觀察該卵黃抗體對(duì)點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能和腸道形態(tài)的影響，探討抗腸炎功能蛋白在點(diǎn)帶石斑魚飼料中的適宜添加量，以期為我國(guó)水產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與分組

抗腸炎功能蛋白由貝瑞康生物科技有限公司提供;健康點(diǎn)帶石斑魚幼魚由天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司提供，平均體重（64.80±0.56）g。試驗(yàn)用魚經(jīng)消毒處理，飼養(yǎng)馴化1周后,挑選體質(zhì)健康、個(gè)體大小均勻的幼魚640尾，采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，平均分為4個(gè)試驗(yàn)組，每組4個(gè)重復(fù)，每桶40尾。對(duì)4組魚初始體重進(jìn)行方差整齊性分析，組間差異不顯著，然后開(kāi)始正式試驗(yàn)[6]。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方法

在基礎(chǔ)飼料（P0）中分別按0.1%（P0.1）、0.2%（P0.2）、0.3%（P0.3）的比例添加抗腸炎功能蛋白，基礎(chǔ)飼料配方和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。將不同比例的抗腸炎功能蛋白分別溶于適量水中，均勻拌在基礎(chǔ)飼料表面，待充分吸收后，再分別添加0.08%海藻酸鈉進(jìn)行包裹處理。飼料自然風(fēng)干后于陰涼干燥處保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在天津市海發(fā)珍品實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司養(yǎng)殖車間進(jìn)行，正式試驗(yàn)共105 d。采用循環(huán)海水養(yǎng)殖，試驗(yàn)魚在圓桶內(nèi)（直徑100 cm，高80 cm）養(yǎng)殖，水深50 cm。每個(gè)圓桶循環(huán)海水經(jīng)過(guò)濾、除蛋白、殺菌、充液氧等處理后進(jìn)入養(yǎng)殖桶，其流量為4 L/min。試驗(yàn)期間水溫為25～27 ℃,鹽度為28～30，pH值為7.6～8.0，溶氧為6～8 mg/l。日投餌 2次，時(shí)間為7:30和17:00，每天投飼量為魚體重的1%～2%，每次投喂過(guò)程持續(xù)30 min至1 h，之后吸取殘存餌料，65℃烘干稱重且從投飼量中扣除殘飼。根據(jù)魚體重量及攝食情況，及時(shí)調(diào)整投喂量。日換水2次，換水時(shí)清理糞便。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及營(yíng)養(yǎng)水平(%)

1.4 采樣及分析方法

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)停食24 h，使用MS-222麻醉石斑魚后進(jìn)行稱重及解剖取樣。

生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定：在試驗(yàn)開(kāi)始、結(jié)束分別對(duì)魚體進(jìn)行稱重。計(jì)算成活率（SR）、增重率（WGR）和飼料系數(shù)（FC）。計(jì)算公式如下：

式中：N0——試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)魚體總尾數(shù)（尾）；

Nt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體總尾數(shù)（尾）；

W0——試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)魚體重（g）；

Wt——試驗(yàn)結(jié)束時(shí)魚體重（g）；

F——飼料總攝入量（g）。

腸道掃描電鏡取樣：取出內(nèi)臟團(tuán)，分離腸道，剔除表面脂肪組織，取中腸1 cm左右大小的組織2塊，縱向剖開(kāi)固定于泡沫板上，使腸黏膜層暴露于空氣中，用生理鹽水沖洗3～4次，除去其上所帶的血液、糞便等雜質(zhì),滴兩滴4%的戊二醛固定液固定5 min左右，然后放入裝有4%戊二醛固定液的玻璃小瓶中，制得腸道樣品。

掃描電鏡腸道樣品置于4%戊二醛固定液中，超聲波洗滌10 min，更換固定液再次洗滌，直至固定液透亮無(wú)雜質(zhì)，然后更換固定液保存。制樣時(shí)將組織塊取出，用0.1 mol/l pH值7.2的磷酸鹽緩沖液沖洗3次，適當(dāng)修剪,1%鋨酸固定1 h，磷酸鹽緩沖液再?zèng)_洗3次，然后用叔丁醇系列梯度脫水，真空干燥，噴鍍，日立S-4700型冷場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察、拍照。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS16.0經(jīng)One-Way ANOVA分析后進(jìn)行Dun?can's多重比較法分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異顯著性，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗腸炎功能蛋白對(duì)點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能的影響（見(jiàn)表2）

表2 抗腸炎功能蛋白對(duì)點(diǎn)帶石斑生長(zhǎng)性能的影響

表2顯示，與P0組相比，添加抗腸炎功能蛋白對(duì)點(diǎn)帶石斑魚的成活率、增重率、飼料系數(shù)均有不同程度的影響。其中，成活率由高到低順序依次為P0.2＞P0.1＞P0.3＞P0，且 P0.2組的成活率顯著高于 P0組（P＜0.05），提高6.6%；P0.1組和P0.3組成活率略高于P0組，但差異不顯著。增重率由高到低順序依次為P0.3＞P0.2＞P0.1＞P0，P0.2、P0.3組的增重率顯著高于 P0組（P＜0.05），提高了9.3%～13.9%。飼料系數(shù)從低到高順序依次為P0.3＜P0.2＜P0.1＜ P0，且各添加組均顯著低于P0組（P＜0.05），下降幅度為9.4%～12.0%。上述結(jié)果表明，在飼料中添加抗腸炎功能蛋白能降低飼料系數(shù)，達(dá)到節(jié)約飼料、提高增重率和成活率的目的，其適宜添加量是0.2%～0.3%。

2.2 抗腸炎功能蛋白對(duì)點(diǎn)帶石斑魚腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響（見(jiàn)圖1～8）

掃描電鏡結(jié)果顯示：放大倍數(shù)為100倍時(shí)發(fā)現(xiàn)點(diǎn)帶石斑魚中腸黏膜皺褶排列規(guī)則、整齊，呈“S”形走勢(shì)。P0.2和P0.3組腸黏膜皺褶間距明顯比P0組小，“S”形走勢(shì)更明顯，說(shuō)明腸道皺褶的表面積更大；P0.1組與P0組差異不是很明顯，“S”形走勢(shì)趨于平緩。放大倍數(shù)為20 000倍時(shí)發(fā)現(xiàn)，P0.2和P0.3組腸道微絨毛較P0組細(xì)而密且排列整齊，進(jìn)一步增大了微絨毛吸收養(yǎng)分的表面積：P0.1組與P0組差異不明顯。掃描電鏡結(jié)果表明，抗腸炎功能蛋白的添加能改善點(diǎn)帶石斑魚的腸道微細(xì)結(jié)構(gòu)，增加食物的吸收面積。

圖1 P0組（×100）腸內(nèi)壁黏膜皺褶

圖2 P0.1組（×100）腸內(nèi)壁黏膜皺褶

圖3 P0.2組（×100）腸內(nèi)壁黏膜皺褶

圖4 P0.3組（×100）腸內(nèi)壁黏膜皺褶

圖5 P0組（×20 000）腸絨毛密度

圖6 P0.1組（×20 000）腸絨毛密度

圖7 P0.2組（×20 000）腸絨毛密度

圖8 P0.3組（×20 000）腸絨毛密度

3 討論

隨著對(duì)應(yīng)激反應(yīng)研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)炎癥無(wú)論是在人還是動(dòng)物的疾病的發(fā)生機(jī)制和健康上都起著關(guān)鍵的作用。免疫系統(tǒng)以其難以置信的復(fù)雜性，高效地對(duì)抗入侵機(jī)體的各種病原。一旦免疫系統(tǒng)被激活，機(jī)體就會(huì)迅速地通過(guò)釋放各種信號(hào)分子、蛋白或者通過(guò)一系列的特定的細(xì)胞來(lái)對(duì)抗?jié)撛诘耐{。在此過(guò)程中，機(jī)體的新陳代謝消耗非常高?？鼓c炎卵黃抗體主要功能是通過(guò)抑制腸道炎癥發(fā)生，避免免疫系統(tǒng)的過(guò)分激活，從而減少機(jī)體在新陳代謝中的能量和營(yíng)養(yǎng)的消耗，把這部分“節(jié)約”下來(lái)的能量和營(yíng)養(yǎng)用于動(dòng)物的生長(zhǎng)和繁殖等方面。同時(shí)抗腸炎功能蛋白能改善腸道健康水平，提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能和改善機(jī)體健康狀況。蛋白粉的營(yíng)養(yǎng)全面，含有較高的蛋白質(zhì)含量和豐富的脂類,且蛋白質(zhì)生物價(jià)高，必需氨基酸組成合理、含量豐富,尤其是經(jīng)過(guò)特殊加工工藝后保存了卵黃中的免疫球蛋白、卵黃高磷蛋白、唾液酸低聚糖、溶菌酶等多種可以提高免疫力、抵抗細(xì)菌、病毒的生物活性物質(zhì)[7-8]。蛋白粉添加到飼料中一方面補(bǔ)充了動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)成分，另一方面多種氨基酸組成改善了飼料的適口性，對(duì)動(dòng)物有良好的誘食性[9]。李肖梁等將滅活的嗜水氣單胞菌免疫產(chǎn)蛋雞，將得到的卵黃加入一定的賦形劑，干燥后按0.2%的比例添加到中華鱉日糧中，發(fā)現(xiàn)中華鱉日增重比對(duì)照組和0.2%無(wú)特異IgY添加劑組分別提高21.73%和7.24%，攝食時(shí)間分別縮短24.15%和26.06%，飼料系數(shù)分別降低13.55%和5.6%[10]。本試驗(yàn)也得到同樣的效果：抗腸炎卵黃抗體的添加可使點(diǎn)帶石斑魚的成活率提高3.0%～6.6%，增重率提高9.3%～13.9%，飼料系數(shù)下降9.4%～12.0%;在平時(shí)的飼養(yǎng)過(guò)程中觀察到，試驗(yàn)組的點(diǎn)帶石斑魚搶食更兇猛,能縮短喂養(yǎng)時(shí)間，這可能與卵黃抗體中含有多種氨基酸和生物活性物質(zhì),以及具有很好的誘食作用有關(guān)。

腸道不僅僅是一個(gè)重要的消化和吸收器官，也是體內(nèi)最大的免疫防御器官、內(nèi)分泌器官和重要的代謝器官，腸道的損傷通常會(huì)引起動(dòng)物肝臟和其他器官的損傷，腸道損傷是引發(fā)多器官損傷和功能障礙的始發(fā)器官[11]。但因腸黏膜與腸腔內(nèi)大量的細(xì)菌及毒素廣泛接觸,腸道也是機(jī)體受威脅最大的部位。機(jī)體70%以上的免疫細(xì)胞集中在腸道,在腸道產(chǎn)生炎癥反應(yīng)的生理生化過(guò)程中要消耗大量的能量，動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)增重下降、食欲降低、飼料回報(bào)率降低以及對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力下降等情況[12]。因此，防止腸道炎癥的發(fā)生，保持其健康水平是提高動(dòng)物生產(chǎn)效能的首要因素。有研究表明，在早期斷奶仔豬日糧中添加高免全蛋粉,能有效提高仔豬的生長(zhǎng)性能，改善腸道組織形態(tài)和提高飼料表觀消化率，從而降低養(yǎng)殖成本[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，抗腸炎功能蛋白的添加可縮小點(diǎn)帶石斑魚腸道黏膜皺褶間距，使腸道微絨毛變得緊密細(xì)長(zhǎng)，擴(kuò)大腸道絨毛與食物接觸表面積，有利于食物的消化吸收，這也是抗腸炎功能蛋白能夠提高點(diǎn)帶石斑魚生長(zhǎng)性能的主要原因。

4 結(jié)論

在種質(zhì)、養(yǎng)殖環(huán)境等各方面條件一致的情況下，抗腸炎卵黃抗體作為綠色飼料添加劑在基礎(chǔ)飼料中添加0.2%～0.3%，能達(dá)到提高點(diǎn)帶石斑魚的生產(chǎn)性能、改善腸道形態(tài)、減少用藥和提高養(yǎng)殖效益的目的。