荀文娟，侯冠彧，周漢林，施力光，曹 婷

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南儋州571737）

Kiss－1基因于1996年被發(fā)現(xiàn)，并被鑒定為轉(zhuǎn)移抑制基因，在具有不同轉(zhuǎn)移能力的黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)存在差異［1］。隨后該基因編碼的產(chǎn)物kisspeptin被發(fā)現(xiàn)，G 蛋白偶聯(lián)受體54（G protein－coupled receptor 54，GPR54）是kisspeptin 的受體。在人、牛、羊、鼠等哺乳動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1 基因與GPR54基因一起組成Kiss－1／GPR54系統(tǒng)，參與動(dòng)物下丘腦－垂體－性腺軸功能的調(diào)節(jié)［2］。Lents等［3］研究發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)注射Kisspeptin后備母豬初情日齡提前。Tomikawa等［4］也在初情期母豬下丘腦中檢測到Kiss－1基因高水平表達(dá)，表明下丘腦Kiss1／GPR54可能是母豬初情啟動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因。鑒于Kiss－1基因在初情期啟動(dòng)調(diào)控中的重要性，本研究推測Kiss－1基因可能與五指山豬高繁殖力和性早熟有關(guān)。一直以來，中國地方品種豬的高繁殖能力始終是中外學(xué)者的研究熱點(diǎn)。五指山豬產(chǎn)于海南省，是我國體型最小、體重最輕的珍稀品種，具有繁殖率高、性成熟早等特性［5］。

本試驗(yàn)以五指山豬作為研究對象，檢測Kiss－1／GPR54系統(tǒng)在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達(dá)，從而為闡明動(dòng)物生殖機(jī)理和早熟品種選種選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取日齡相近、健康、無生殖缺陷五指山母豬16頭，分別于30、60、90（初情期）和120日齡屠宰，采集血清和下丘腦組織樣品，血清樣品于－20 ℃冰箱保存，組織樣品液氮速凍，－70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器

RNAiso Plus 總RNA 提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒（SYBR R Premix Ex TaqTM）購自Takara；熒光定量PCR 儀購自eppendorf。

1.3 總RNA 的提取及cDNA 第一鏈合成

采用TaKaRa公司RNAiso Plus試劑盒提取總RNA。用變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA 的品質(zhì)，并用核酸蛋白測定儀測定其濃度及純度。采用SYBR?PrimeScriptTM RT－PCR reagent Kit中的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑進(jìn)行cDNA 第一條鏈的合成。

1.4 引物設(shè)計(jì)

從NCBI下載已登錄的豬持家基因序列β－actin（DQ178122）、豬Kiss－1（AB466320）和GPR54（DQ459345）的mRNA 序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)合成兩對特異性引物，分析Kiss－1和GPR54在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達(dá)水平。引物信息見表1。

表1 熒光定量PCR 所用引物序列Table 1 Primer sequences of quantitative real－time PCR

1.5 Real－time PCR

根據(jù)SYBR?Premix Ex TaqTM II試劑盒建議的反應(yīng)體系及優(yōu)化確定的反應(yīng)條件，將設(shè)計(jì)并合成好的目的基因和看家基因的引物，分別加入反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq II：12.5μL，PCR Forward Primer：1μL，PCR Reverse Primer：1μL，cDNA 溶液2μL，ddH2O：8.5μL，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)熱30s，PCR 循環(huán)參數(shù)為：變性95.0 ℃5s；退火60.5 ℃／58.5 ℃20s；延伸72 ℃10s，循環(huán)40 次。

1.6 血清FSH、LH、E2、P4 的測定

血清FSH、LH、E2、P4用化學(xué)發(fā)光法測定。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

目的基因的相對表達(dá)量采用－ΔΔCT 方法獲得，ΔCT 就是Kiss－1 和GPR54 相對內(nèi)參β－actin的表達(dá)量，ΔΔCT 為每個(gè)試驗(yàn)組的ΔCT 與對照組的相對數(shù)值，目的基因的相對表達(dá)水平用2－ΔΔCT 表示。所有數(shù)據(jù)用Excel進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，用SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異顯著水平，P＜0.01為差異極顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kiss－1mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達(dá)

由圖1可知，初情期前Kiss－1mRNA 表達(dá)量隨著五指山豬年齡的增長表達(dá)量逐漸升高，初情期（90日齡）時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（P＜0.05），到120日齡（初情期后）時(shí)表達(dá)量逐漸降低（P＜0.05）。

圖1 Kiss－1mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達(dá)Fig.1 Expression of Kiss－1mRNA in hypothalamus in different age of Wuzhishan pig

2.2 GPR54 mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達(dá)

由圖2 可知，GPR54 mRNA 表達(dá)量隨著五指山豬年齡的增長有升高的趨勢，但是差異不顯著（P＞0.05）。

圖2 GPR54mRNA 在不同發(fā)育階段五指山豬下丘腦中的表達(dá)Fig.2 Expression of GPR54mRNA in hypothalamus in different age of Wuzhishan pig

2.3 五指山豬30～120dFSH、LH、E2、P4 濃度變化

由表2 可知，五指山豬血清FSH、LH、E2、P4濃度變化的趨勢大體一致。初情期前，各激素水平逐漸升高，差異不顯著（P＞0.05），至初情期（90日齡）時(shí)顯著升高；血清FSH、LH、E2濃度在90日齡和120日齡時(shí)差異不顯著（P＞0.05），P4濃度在90日齡時(shí)顯著高于120日齡（P＜0.05）。

表2 五指山豬30－120日齡之間FSH、LH、E2、P4 濃度變化Table 2 Concentration changes of FSH，LH，E2，and P4of Wuzhishan pig from 30－day－old to 120－day－old

3 討論

Yasuko等［6］近年來研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1 基因參與調(diào)控下丘腦－垂體－性腺軸系生殖功能。在青春期，下丘腦中的Kiss－1 mRNA 表達(dá)增加，其編碼產(chǎn)物Kisspeptin與其受體GPR54結(jié)合，通過GnRH 刺激LH 和FSH 的釋放［7］。劉小輝等［8］用達(dá)那唑皮下注射，以誘導(dǎo)大鼠真性性早熟，表明處于青春期的大鼠下丘腦Kiss－1mRNA 表達(dá)量顯著高于青春前期。葛偉等［9］在雌性大鼠上也得出了相似結(jié)論?？梢姡琄iss－1mRNA 的表達(dá)與生長發(fā)育的時(shí)期密切相關(guān)，提示Kiss－1可能與性早熟的發(fā)生有關(guān)。本研究中，在初情期前，Kiss－1表達(dá)量隨著五指山豬年齡的增長呈現(xiàn)不斷升高的趨勢，初情期（90日齡）時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高（P＜0.05），隨后表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），表明Kiss－1對五指山母豬初情期的啟動(dòng)起重要的作用。劉萍［10］對Kiss－1 mRNA 在小梅山豬和蘇姜豬下丘腦的表達(dá)情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)小梅山豬和蘇姜豬從初生到初情期表達(dá)量逐漸上升，初情期后呈下降趨勢，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。而Shahab等［11］研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1和GPR54mRNA 在雌性猴子下丘腦的表達(dá)量隨著青春期發(fā)育過程逐漸升高，但在去勢雄性猴子中則只觀察到Kiss－1 mRNA 表達(dá)量增加，GPR54mRNA 表達(dá)量并未受影響。本研究中，下丘腦GPR54基因的變化不顯著，這一結(jié)果與去勢雄性猴和其他學(xué)者關(guān)于豬的研究結(jié)果相一致［11－12］。GPR54基因變化與其他物種不同可能與其配體對受體上調(diào)幅度有關(guān)［13］?？梢姡琄iss－1／GPR54在不同物種及性別個(gè)體青春期發(fā)育過程中的作用途徑還有待深入研究。

自研究者發(fā)現(xiàn)Kiss－1／GPR54 系統(tǒng)在生殖功能調(diào)控中的重要作用以來，Kisspeptin及其受體對生殖的調(diào)控迅速成為研究的熱點(diǎn)。性激素對下丘腦Kiss－1表達(dá)具有反饋抑制作用。Gottsch等［14］研究發(fā)現(xiàn)，給成年鼠注射極少量的Kisspeptin就可以引起其血清中LH 顯著增加。而對于幼年小鼠，只有高劑量的Kisspeptin 才能引起LH 含量變化。Brailoiu等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Kisspeptin神經(jīng)纖維投射到弓狀核、視前區(qū)、視交叉后區(qū)等，這些區(qū)域是調(diào)控動(dòng)物生殖GnRH 分泌的主要神經(jīng)核團(tuán)所在區(qū)域，由此提示Kisspeptin參與GnRH 分泌的激素調(diào)控。劉萍［10］研究發(fā)現(xiàn)，Kiss－1mRNA 在各日齡小梅山豬的表達(dá)豐度與血漿LH、FSH、E2和P4水平相似并呈顯著相關(guān)。本試驗(yàn)也得出了類似的結(jié)果，五指山豬血清FSH、LH、E2、P4水平在初情期前逐漸升高，至初情期時(shí)顯著升高，且達(dá)到一個(gè)峰值，與Kiss－1mRNA 表達(dá)豐度基本一致。說明Kiss－1mRNA 水平與初情期前后性激素分泌水平具有相似周期變化規(guī)律，證實(shí)Kiss－1基因?qū)ξ逯干侥肛i初情期的啟動(dòng)具有重要的調(diào)控作用。

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