劉 璐，傅旭陽，付明哲，趙寶玉＊

（西北農(nóng)林科技大學(xué)1.理學(xué)院；2.動物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌712100）

急彎棘豆（Oxytropisdeflexa）系豆科棘豆屬植物，廣泛分布在我國西北、華北、西南等地，主要生長在海拔3 000m以上草坡地［1］，急彎棘豆全草在藏藥和蒙古藥中廣泛使用，民間多用于消炎、解毒、抗菌、鎮(zhèn)靜和鎮(zhèn)痛等［2］。急彎棘豆全草中含有黃酮類化合物，以黃酮甙為主要成分［3］。許多研究已表明黃酮類化合物具有多種生物活性，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面有顯著效果，已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域［4］。傳統(tǒng)溶劑熱提取急彎棘豆黃酮存在提取時間長、所用溶劑量大、雜質(zhì)多、有效成分低、成本高等缺點(diǎn)，嚴(yán)重阻礙了我國棘豆黃酮類化合物的開發(fā)利用［5］。近年來，超聲波輔助提取黃酮類化合物的工藝已有一定報(bào)道［6］，超聲波具有空化、湍流、界面和聚能效應(yīng)，能破裂植物細(xì)胞、促進(jìn)溶劑滲透，輔助提取溫度低、時間短、產(chǎn)率高［7］。但目前尚未見棘豆中黃酮類化合物的超聲提取工藝報(bào)道。本研究通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)探索超聲波提取棘豆黃酮的工藝參數(shù)，篩選提取的最佳提取條件，為合理開發(fā)利用棘豆屬植物資源提供可靠依據(jù)［8］。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試樣品 急彎棘豆2010年8月采自青海省祁連草地，經(jīng)陰干、去雜、粉碎過20目篩備用。

1.1.2 試 劑 蘆丁對照品（中國藥品生物品檢定所，批號10080－200306）。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ－1500DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TU－1901紫外光譜儀，普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 棘豆總黃酮的提取 稱取3g急彎棘豆干粉，在乙醇中超聲提取，過濾，合并兩次濾液，濃縮，石油醚除去油脂和色素，將乙醇部分轉(zhuǎn)移到50mL容量瓶，用甲醇定容，作為樣品提取液。

1.3.2 棘豆總黃酮的測定［9］

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確吸取0.542mg／mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50mL于8只10mL容量瓶中，加入1mL 1%三氯化鋁甲醇液，定容，放置15 min，以不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液為空白，于274nm 波長下測定吸光度。以吸光度對蘆丁含量作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 總黃酮的測定 取樣品提取液3 mL 于10mL容量瓶，以相應(yīng)試劑做空白，用三氯化鋁顯色法，分別于274nm 處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出急彎棘豆總黃酮含量。

1.3.3 單因素試驗(yàn) 選取超聲功率、料液比、超聲時間、乙醇濃度、提取溫度5個因素，以測定的總黃酮含量為指標(biāo)，確定各因素的適宜范圍，見表1。

表1 單因素試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of single factor experiment

1.3.4 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲溫度、時間、料液比、超聲功率為主要因素，以樣品中總黃酮的提取率為指標(biāo)，按照表2L9（34）正交設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表2 （L934）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 （L934）Orthogonal experiment design method

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性質(zhì)量

蘆丁的回歸方程為A＝0.419C＋0.0249，其中A 為吸光度，C 為蘆丁濃度（μg／mL），R2＝0.9992，實(shí)驗(yàn)表明，在0～38μg／mL 范圍內(nèi)，蘆丁與吸光度值線性關(guān)系良好，如圖1。

2.2 超聲提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲波功率對提取效果的影響 由圖2可知，超聲功率對棘豆總黃酮的提取有一定影響。隨著提取功率的增加，總黃酮的含量呈上升趨勢，功率在800左右提取率最大。超過800 W 隨著功率的增加反而下降，因此，將正交試驗(yàn)中超聲功率確定為范圍600～800 W 較適宜。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of rutin

圖2 超聲功率對總黃酮提取含量的影響Fig.2 The effect of Ultrasonic power on the concentration of flavones

2.2.2 料液比對提取效果的影響 從圖3可知，在超聲功率、提取溫度和提取時間一定的條件下，1∶05～1∶20時提取出棘豆總黃酮的含量呈逐漸上升趨勢，1∶15～1∶20棘豆總黃酮含相對平穩(wěn)，但當(dāng)料液比達(dá)1∶25其含量有所下降，故料液比以1∶20為宜。

2.2.3 超聲時間對棘豆總黃酮的提取有一定影響

從圖4可以看出，隨著提取時間的增加提取出的黃酮含量呈上升趨勢，45～60 min 時提取率最高，但在60min之后，隨著超聲時間的增加反而下降，75min后與超聲15min時含量相當(dāng)，比含量最高時下降13.16%左右。因此，將正交試驗(yàn)中的超聲時間定為45～60min。

2.2.4 溫度對超聲提取效果的影響 棘豆總黃酮在乙醇中的擴(kuò)散與溫度有密切關(guān)系。從圖5可知，30 ℃～60 ℃之間，黃酮含量隨著溫度的升高呈上升趨勢，但在75 ℃時黃酮含量有所下降，75 ℃時總黃酮含量與35℃時相差無幾，因此，將正交試驗(yàn)中的超聲溫度定為45 ℃。

2.2.5 乙醇濃度對提取效果的影響 從圖6可以看出，當(dāng)乙醇濃度在30%～60%時，棘豆總黃酮含量逐漸增加；當(dāng)乙醇濃度到達(dá)60%時相對提取率最高；當(dāng)乙醇濃度大于70%時，隨著乙醇濃度的增加，黃酮含量有減少的趨勢；當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時黃酮含量含量比60%時下降了10.00%，因此，將正交試驗(yàn)中乙醇濃度定為60%～70%。

圖3 料液比對總黃酮提取含量的影響Fig.3 Effect of ratio of material to solvent volum on the concentration of flavones

圖4 提取時間對總黃酮提取含量的影響Fig.4 The effect of time on the concentration of flavones

2.3 超聲波輔助提取正交試驗(yàn)

由正交試驗(yàn)結(jié)果可見，影響急彎棘豆超聲輔助提取的主要因素依次為超聲功率、超聲時間、溫度、和料液比。料液比與超聲時間對提取無顯著性影響（P＞0.05），溫度與超聲功率對提取有顯著影響性（P＜0.05）。確定最佳工藝為D2B2C2A1，即乙醇濃度到達(dá)60%，超聲45min；超聲溫度為45 ℃，料液比為1∶10，超聲功率為800 W，結(jié)果見表3、4。

圖5 不同溫度對總黃酮提取含量的影響Fig.5 Effect of different temperature on the concentration of flavones

圖6 不同乙醇濃度對提取含量的影響Fig.6 The effect of concentration of ethanol on the concentration of flavones

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of orthogonal experiment

表4 方差分析結(jié)果Table 4 The analysis of variance

2.4 提取工藝驗(yàn)證

精密稱取急彎棘豆樣品6g，按照最佳工藝條件對急彎棘豆進(jìn)行提取（n＝4），三氯化鋁比色法測得急彎棘豆總黃酮含量為1.97%，結(jié)果見表5。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of optimum extraction technology

3 討論

超聲波具有空化、粉碎、攪拌等特殊作用，能促進(jìn)溶質(zhì)浸潤，增加傳質(zhì)面積，破壞植物細(xì)胞，產(chǎn)生瞬間高壓場，導(dǎo)致超臨界現(xiàn)象，提高擴(kuò)散系數(shù)［10］。與常規(guī)提取法相比，超聲波加速了提取速度，縮短了提取時間，降低了提取溫度，提高了提取率［11］。

超聲波的功率越高越容易獲得較大的聲強(qiáng)，與介質(zhì)相互作用時，超聲強(qiáng)度更起決定性作用［12］。超過800 W 超聲功率的提取率開始下降，可能是功率過高時，提取液的溫升較大，造成部分黃酮物質(zhì)因受熱損失較大；同時溶劑揮發(fā)速度加快，提取液濃度增大，致使黃酮類物質(zhì)不易完全溶出［13］。

料液比影響溶劑的極性，從而影響不同極性黃酮類物質(zhì)的溶解性。料液小于1∶20時，增加溶劑用量可增大溶劑對黃酮的溶解能力，棘豆細(xì)胞內(nèi)的黃酮與浸提液之間的黃酮濃度差較大，擴(kuò)散推動力大，超聲場中的湍動效應(yīng)有利于黃酮向浸提液擴(kuò)散。當(dāng)繼續(xù)提高溶劑用量，能耗及成本也隨之增大，還因?yàn)槿軇┲械牡鞍踪|(zhì)、碳水化合物和果膠可能與黃酮結(jié)合生成沉淀或吸附黃酮，從而減少了棘豆總黃酮的浸出率［14］。綜合考慮選擇1∶10的料液比。

從超聲波提取時間來看，提取率隨超聲作用時間增加，達(dá)到一個極限值后提取率反而減?。?5］。延長時間可以增加棘豆總黃酮的浸出量，提高黃酮浸出率。當(dāng)時間在60min時，黃酮的浸出量并沒有太大的變化。這是因?yàn)榇藭r棘豆黃酮向溶液擴(kuò)散速度與溶液中黃酮向棘豆擴(kuò)散的速度達(dá)到了平衡。但當(dāng)提取時間達(dá)到75min時，黃酮的浸提率出現(xiàn)了明顯的降低，原因可能有兩個：一隨著萃取時間的延長，可能造成部分黃酮類物質(zhì)被氧化；二是超聲作用時間太長，使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低［16］。因此，超聲萃取棘豆的總黃酮時間不宜太長。

溫度升高，可軟化植物組織，增加溶解度和擴(kuò)散速度，促進(jìn)有效成分浸出。隨著溫度的升高黃酮浸出率逐漸增大，這是由于溫度的升高有利于增加棘豆總黃酮的溶解度和擴(kuò)散速度［17］。但90 ℃時，急彎棘豆總黃酮的浸出率明顯降低，可能是黃酮在高溫時性質(zhì)不穩(wěn)定受熱易變性；此外，溫度太高時，乙醇揮發(fā)加快，影響棘豆總黃酮的浸出率［18］。

乙醇濃度對總黃酮提取有較大影響［19］。超過70%時，黃酮的提取率反而下降了。這是因?yàn)辄S酮的極性較小，黃酮易溶于中等或中等偏下極性溶劑中。當(dāng)乙醇濃度低時，黃酮的溶解度也低。當(dāng)乙醇濃度增高后，乙醇分子之間不但彼此以氫鍵相結(jié)合，而且和水分子也形成氫鍵，降低了水的極性，故黃酮的溶解度增加［20］。隨著乙醇濃度超過70%后，一些醇溶性雜質(zhì)、色素、親脂性強(qiáng)的成分溶出量增加［21］。因此將乙醇濃度確定在60%左右。

［1］李玉林，廖志新，杜玉枝，等.棘豆屬植物化學(xué)成分研究概況［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2002，14（5）：75－79.

［2］馬彥梅，周文明，楊新娟.棘豆屬植物化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，20（2）：167－170.

［3］文開新，王成章，嚴(yán)學(xué)兵，等.黃酮類化合物生物學(xué)活性研究進(jìn)展［J］.草業(yè)科學(xué)，2010，27（6）：115－122.

［4］Cushnie T P，Lamb A J.Antimicrobial activity of flavonoids［J］.Antimicrob Agents，2005，26（5）：343－356.

［5］楊光明，王 棟.鐮形棘豆總黃酮和總酚的含量測定［J］.藥學(xué)與臨床研究，2009，17（5）：376－378.

［6］李 華，沈 潔.超聲波法從葡萄籽中提取多酚的研究［J］.釀酒科技，2005，7（5）：89－91.

［7］曾 里，夏之寧.超聲波和微波對中藥提取的促進(jìn)和影響［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2002，14（3）：245－249.

［8］劉 璐.棘豆屬植物黃酮測定方法與超聲波輔助提取工藝研究［D］.陜西：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2010.

［9］劉 璐，付明哲，趙寶玉，等.急彎棘豆總黃酮含量的紫外分光光度法測定［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2010，31（11）：59－62.

［10］鄭 艷.青刺果總黃酮的提取工藝及其對肉雞的免疫調(diào)節(jié)作用［D］.重慶：西南大學(xué)，2008.

［11］高 輝，杜 鵑.超聲波輔助提取苦苣總黃酮的工藝研究［J］.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)，2012，33（1）：21－22.

［12］陳 蕾，于 娟，李曉蕙.超聲法提取駱駝蒿總生物堿的工藝研究［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（3）：158－162.

［13］張艷軍，彭重威，徐淑慶，等.銀葉樹樹葉中總黃酮提取工藝優(yōu)化［J］.中藥材，2012，35（4）：640－641.

［14］郭 輝，羅宇倩，章華偉，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取荷葉黃酮工藝［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2011，11（1）：121－124.

［15］馬振千.紫花地丁總黃酮提取實(shí)驗(yàn)研究［D］.天津：天津大學(xué)，2008.

［16］賈韶千，吳彩娥，李艷霞.枸杞中黃酮類化合物的超聲波強(qiáng)化提取.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)第，2009，40（5）：131－134.

［17］黃運(yùn)紅，高興強(qiáng)，黎偉偉，等.超聲法提取臍橙皮黃酮類化合物的工藝研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（16）：102－105.

［18］張 然，王 晶，朱春花，等.超聲波提取蘇芡黃酮類化合物工藝［J］.食品科學(xué)2010，31（1）：247－250.

［19］Zhou T，Luo D，Li X，et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects of flavonoids from lotus（Nelumbo nuficeraGaertn）leaf in diabetic mice［J］.Journal of Medicinal Plants Research，2009，3（4）290－293.

［20］喬東東，張 云，尤新軍，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)－效應(yīng)面法優(yōu)化梓樹果實(shí)總黃酮的超聲提取工藝［J］.西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，25（3）：170－171.

［21］馮宗帥，吳彩娥，方升佐，等.青錢柳葉總黃酮超聲輔助提取工藝優(yōu)化［J］.農(nóng)業(yè)機(jī)械學(xué)報(bào)，2009，40（2）：130－134，75.