趙 琳，賈鯤鵬，王 璐，陳美霓，王亞萍，楊彥玲

（1.延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院，2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院，陜西 延安716000）

增食欲素-A（orexin-A）是下丘腦合成和分泌的具有神經(jīng)興奮作用的神經(jīng)肽，參與攝食、能量代謝、應(yīng)激等生理活動(dòng)的調(diào)節(jié)。Orexin-A神經(jīng)元屬于葡萄糖敏感型神經(jīng)元，血糖的下降可以刺激下丘腦外側(cè)區(qū)（later hypothalamus area，LHA）的orexin-A神經(jīng)元。但是低血糖應(yīng)激狀態(tài)下orexin-A的表達(dá)變化如何，orexin-A與胰島素之間的相互影響并不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用胰島素誘導(dǎo)的急性低血糖大鼠模型，研究下丘腦orexin-A的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠抗orexin-A抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；生物素標(biāo)記的驢抗小鼠血清購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司；AB復(fù)合物購(gòu)自美國(guó)Vector公司；DAB顯色劑試劑盒、顯影液和封片劑購(gòu)自中國(guó)北京中杉公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

健康成年SD大鼠24只（雄性，250～300 g），由延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，隨機(jī)分為三組（n＝8）。低血糖進(jìn)食組大鼠皮下注射胰島素（50 U／kg），自由進(jìn)食和飲水；低血糖禁食組大鼠皮下注射胰島素（50 U／kg），禁食5 h，但可自由飲水；正常對(duì)照組大鼠不予任何處理，動(dòng)物正常進(jìn)食、飲水。

1.3 灌注與取材

造模5 h后，用2%異戊巴比妥鈉（40 mg／kg）腹腔注射麻醉，之后斷尾取血用微型血糖儀測(cè)定血糖，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清胰島素水平。補(bǔ)加戊巴比妥鈉（至80 mg／kg）深麻大鼠，剪開胸骨，經(jīng)升主動(dòng)脈插管，剪開右心耳，先用100 ml生理鹽水快速?zèng)_血，用4%多聚甲醛（pH 7.4）持續(xù)灌注1 h左右，取腦，置入30%蔗糖溶液（pH 7.4），4℃冰箱過(guò)夜。取下丘腦部分（乳頭體至視交叉）行冰凍切片。

1.4 免疫組化染色

切片經(jīng) 0.01 mol／L PBS（pH 7.4）反復(fù)漂洗 3次；加入0.3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常山羊血清封閉液室溫封閉1 h；滴加小鼠抗 orexin-A IgG（1∶100），室溫孵育過(guò)夜；生物素標(biāo)記的驢抗小鼠血清（1∶200），室溫4～6 h；AB復(fù)合物（1∶200），室溫 1～2 h。以上各步之間均用 0.01 mol／L PBS漂洗30 min×3次。經(jīng)以上孵育后，用DAB顯色劑進(jìn)行呈色、裱片，第二天乙醇梯度脫水、二甲苯透明、封片。

1.5 灰度值測(cè)量和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每只動(dòng)物選取3張典型切片進(jìn)行orexin-A陽(yáng)性神經(jīng)元的計(jì)數(shù)及灰度值測(cè)量，orexin-A免疫陽(yáng)性產(chǎn)物的灰度值測(cè)量采用Photoshop 7.0分析工具。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件行 t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 胰島素的比較

低血糖進(jìn)食組血糖低于正常對(duì)照組，而低血糖禁食組血糖下降更明顯。血清胰島素水平在低血糖進(jìn)食組和低血糖禁食組都明顯升高 （P＜0.05，表 1）。

Tab.1 Comprision of the levels of serum glucose and insulin in rats，n＝8）

Tab.1 Comprision of the levels of serum glucose and insulin in rats，n＝8）

Group Glucose（mmol／L） Insulin（mIU／L）Control 7.91±0.52 20.51±1.83 Hypoglycemia with feeding 4.20±0.64* 326.82±8.25*Hypoglycemia with fasting 1.92±0.35* 275.98±7.46*

2.2 免疫組化染色

Orexin-A免疫陽(yáng)性產(chǎn)物在對(duì)照組、低血糖進(jìn)食組和低血糖禁食組都有不同程度的表達(dá)，涵蓋下丘腦穹窿周區(qū)、腹外側(cè)、背側(cè)和后區(qū)，低血糖禁食組在穹窿周區(qū)表達(dá)較密集，細(xì)胞呈梭形和卵圓形，局部區(qū)域有團(tuán)塊狀深染產(chǎn)物堆積。Orexin-A陽(yáng)性神經(jīng)元的個(gè)數(shù)平均值在低血糖禁食組為（90±12），明顯多于對(duì)照組（49＋6）（P＜0.05），低血糖進(jìn)食組（54＋8）與對(duì)照組比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖1）。

Fig.1 Expression of orexin-A in perifornical hypothalamus by immunohistochemical staining（Bar＝200μm）

2.3 灰度值測(cè)量

Orexin-A陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值比較，低血糖進(jìn)食組（121＋14）與對(duì)照組（126＋16）比較沒(méi)有明顯變化，而低血糖禁食組灰度值較低，為98±17，與對(duì)照組比較有明顯變化（P＜0.05），顯示 orexin-A染色強(qiáng)度最高（圖 2）。

Fig.2 Comparison of averaged grey value for orexin-A immunopositive neurons

3 討論

Orexin包括orexin-A和orexin-B兩個(gè)單體，因orexin-A具有二硫鍵環(huán)化多肽，所以生化結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，在覺醒和能量平衡中起著重要作用。LHA是一個(gè)經(jīng)典的涉及哺乳動(dòng)物攝食行為調(diào)控的區(qū)域，是下丘腦食欲調(diào)節(jié)的“網(wǎng)絡(luò)中心”之一［1］。給大鼠側(cè)腦室、LHA和穹隆周區(qū)注射orexin-A，可顯著提高其進(jìn)食量［2］。Orexin最初是在LHA及其周圍區(qū)域發(fā)現(xiàn)的，LHA損傷可降低動(dòng)物隨機(jī)進(jìn)食，并可降低禁食和胰島素誘導(dǎo)的低血糖所導(dǎo)致的食欲亢進(jìn)。也有研究發(fā)現(xiàn)低血糖伴有禁食可以損傷LHA，影響LHA某些區(qū)域的神經(jīng)元功能，并且在應(yīng)答禁食的情況下下丘腦prepro-orexin mRNA水平是增加的［3］。

Orexin神經(jīng)元屬于葡萄糖敏感型神經(jīng)元，血糖升高可以抑制它們的功能，血糖下降可以刺激 LHA的 orexin神經(jīng)元［4］，前期的研究發(fā)現(xiàn)，禁食可以促進(jìn)下丘腦orexin-A神經(jīng)元的表達(dá)［5］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠皮下注射胰島素，血糖低于對(duì)照組，在低血糖禁食組下降更明顯。血清胰島素水平在低血糖進(jìn)食組和低血糖禁食組都明顯升高。對(duì)照組和急性低血糖組大鼠下丘腦都呈現(xiàn)不同程度orexin-A表達(dá)，而在低血糖禁食組，orexin-A的表達(dá)明顯增加，灰度值比較也顯示其染色強(qiáng)度最高，而低血糖進(jìn)食組orexin-A表達(dá)和灰度值與正常對(duì)照組比較都沒(méi)有明顯變化，表明急性葡萄糖水平下降可激活下丘腦的orexin-A神經(jīng)元，但這種應(yīng)激可被與進(jìn)食相關(guān)的信號(hào)迅速的抑制。

Griffond等［6］研究發(fā)現(xiàn)，胰島素介導(dǎo)的急性低血糖應(yīng)激可促進(jìn)大鼠orexin的表達(dá)，但這種刺激作用在血糖升高時(shí)消失。胰島素與orexin的相互調(diào)控可能涉及多方面的因素，血清胰島素、血糖及脂代謝變化，其他代謝和內(nèi)分泌敏感因素都可能參與了orexin的調(diào)節(jié)。另外orexin類神經(jīng)元對(duì)血糖減少的刺激并不是十分強(qiáng)烈，在慢性限食時(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）就會(huì)使神經(jīng)元適應(yīng)的利用酮類，部分代償葡萄糖減少所引起的興奮作用。下丘腦orexin系統(tǒng)是血糖下降時(shí)被活化的葡萄糖感覺網(wǎng)絡(luò)的一部分，orexin神經(jīng)元被急性低血糖激活，又被與進(jìn)食相關(guān)的信號(hào)抑制。Orexin神經(jīng)元在維持葡萄糖可獲得性的血糖穩(wěn)態(tài)進(jìn)食機(jī)制中顯示著十分重要的地位。

［1］ Abizaid A，Horvath TL.Brain circuits regulating energy homeostasis［J］.Regul Pept，2008，149（1-3）：3-10.

［2］ Okumura T，Takakusaki K.Role of orexin in central regulation of gastrointestinal functions［J］.J Gastroenterol，2008，43（9）：652-660.

［3］ Cai XJ，Evans ML，Lister CA，et al.Hypoglycemia activates orexin neurons and selectively increases hypothalamic orexin-B levels：responses inhibited by feeding and possibly mediated by the nucleus of the solitary tract［J］.Diabetes，2001，50（1）：105-112.

［4］ Satoh Y，Okishio Y，Azuma YT，et al.Orexin A affects ascending contraction depending on downstream cholinergic neurons and descending relaxation through independent pathways in mouse jejunum［J］.Neuropharmacol，2006，51（3）：466-473.

［5］ 趙 琳，賈鯤鵬，史 娟，等.禁食不同時(shí)段下丘腦穹窿周區(qū)orexin-A的表達(dá)［J］.中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2012，21（6）：563-566.

［6］ Griffond B，Risold PY，Jacquemard C，et al.Insulin-induced hypoglycemia increase preprohypocretin（orexin）mRNA in the rat lateral hypothalamic area［J］.Neurosci Lett，1999，262（2）：77-80.