陶愛群，尹 婷，謝深喜

(1.湖南環(huán)境生物職業(yè)技術學院，湖南 衡陽 421005；2.湖南農業(yè)大學 園藝園林學院，湖南 長沙 410028)

掃描電子顯微鏡能夠直接觀察樣品的表面結構，從多個角度反映出樣品表面的立體形貌[1-2]。在植物組織培養(yǎng)中常用來從形態(tài)學上了解不定器官再生的動態(tài)過程，從而得到了廣泛應用，包括在體細胞胚的發(fā)生過程[3-4]、愈傷組織的形態(tài)變化[5-6]及整個組培的過程研究[7-8]等。本實驗以黃金梨葉片為外植體，利用掃描電鏡觀察葉片再生過程中表面形態(tài)結構的變化及不定器官的發(fā)生動態(tài)，從形態(tài)學水平上研究黃金梨葉片的再生過程，尋找黃金梨葉片的最佳再生途徑，以期為黃金梨的遺傳轉化、選擇非嵌合體轉化植株和誘導育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采摘3 a生黃金梨植株上的1 a生枝條置于人工氣候室內水培，然后取其新萌發(fā)的葉片作試材。

1.2 方法

1.2.1 黃金梨再生

黃金梨葉片經酒精和升汞溶液消毒后，取近中脈的葉片部分切成1cm2大小后用解剖刀輕劃2～3刀，以葉面朝上的方式接種于含不同濃度NAA和6-BA的MS培養(yǎng)基上(見表1)。50d后統(tǒng)計再生率。取葉片上再生的、長1cm～3cm的不定芽接種于含不同濃度IBA的1/2MS培養(yǎng)基上，50d后統(tǒng)計其生根率。每個處理100個葉片，2次重復。用SAS9.1.3軟件處理數據。

表1 培養(yǎng)基配方Table 1 Medium formulations

1.2.2 掃描電鏡觀察

將葉片接種在優(yōu)化培養(yǎng)基上，每隔5d取樣觀察。再生不定芽長到1～3cm時轉接到生根培養(yǎng)基，每隔10d取樣。在進行電鏡觀察前，樣品在2.5％戊二醛PBS緩沖液中4℃固定3d后，用PBS 緩沖洗液漂洗15min，重復3次，再用雙蒸水沖洗15min，重復 2次。然后鋨酸固定1h后，用4℃緩沖液漂洗15min，重復3次備用。備用樣品依次用濃度為30％、50％、70％、85％、95％、100％的丙酮脫水15min，再用乙酸異戊酯置換2h后，CO2臨界點干燥1h，鍍金膜后在掃描電子顯微鏡下觀察和照相[8-9]。

2 結果與分析

2.1 生長調節(jié)劑對黃金梨葉片再生的影響

2.1.1 不同配比的生長調節(jié)劑對黃金梨葉片不定芽的影響

生長素和細胞分裂素的不同配比影響葉片不定芽的產生率和平均再生芽數。從表2可知，葉片再生頻率最高為54％，最低僅3％。6-BA濃度在0.5～1.5mg·L-1、NAA濃度0.1～0.3mg·L-1的不同組合誘導葉片時的再生率和再生芽數無明顯規(guī)律。當培養(yǎng)基的NAA濃度不變，以6-BA濃度為1.0mg·L-1優(yōu)于其它兩個濃度6-BA的培養(yǎng)基。而當培養(yǎng)基的6-BA濃度不變時，NAA0.1～0.3mg·L-1濃度范圍內變化時，濃度為0.2mg·L-1優(yōu)于其它兩個濃度。故選用MS＋0.2mg·L-1NAA＋1.0mg·L-16-BA對黃金梨葉片進行培養(yǎng)，可以獲得相對較高的再生率，可再生出相對多的不定芽。

2.1.2 不同濃度IBA對黃金梨葉片不定根再生的影響

長度1～3cm的不定芽接種于添加不同濃度IBA的1/2 MS生根培養(yǎng)基上進行生根誘導，發(fā)現IBA濃度為3.5mg·L-1時，生根率和再生根數目都優(yōu)于其它供試濃度(見表3)。

2.2 再生過程的掃描電鏡觀察

2.2.1 不定芽發(fā)生過程的掃描電鏡觀察

黃金梨葉片在接種5d后取樣無表觀變化，接種10d后，所有未污染的葉片邊緣卷曲，葉面面積增大，在葉片損傷處和葉脈處產生了白色愈傷組織。接種15d后，肉眼可見部分愈傷組織開始變?yōu)榈S色或淺綠色，質地緊密，數量明顯增多，形成團狀。掃描電鏡觀察此愈傷組織發(fā)現，其表面包被有一層膜，且隨著培養(yǎng)時間的延長，大量凹凸不平的疣狀突起突破膜的包裹；此突起細胞排列致密，內部中空，具有較強的分化能力，是分生組織形成的前體類分生組織(見圖1A)。40d時，肉眼可見愈傷組織團變成深綠色,掃描電鏡下發(fā)現此時的愈傷組織表面密布排列整齊的分生組織(見圖1B，C，D)，但只有接近葉片損傷處或葉脈附近的愈傷組織上的分生組織表面或邊緣才可見不同程度發(fā)育的不定芽，這些不定芽非常小，肉眼很難看到，在顯微鏡下可見已具備不定芽的形態(tài)(見圖1D)。到50d時，肉眼可見不定芽上葉片開始伸展。隨培養(yǎng)時間延長，出現不定芽的葉片數增多，同一葉片上再生不定芽的數量也增多。到80d時，出現不定芽的葉片不再增加，但已產生的不定芽節(jié)間伸長，葉片增大；此時掃描電鏡發(fā)現，葉片上再生出來的部分不定芽莖橫切面呈蜂窩狀或細胞排列緊密(見圖1E，F)，前者應為生長停止或接近死亡，后者生長旺盛。

表2 不同的6-BA 和NAA 組合對黃金梨葉片再生不定芽的影響?Table 2 Effect of different combinations of 6-BA and NAA on adventitious bud regeneration from leaves

表3 不同IBA濃度對黃金梨不定梢生根的影響Table 3 Effect of different IBA concentrations on root regeneration from adventitious shoots

不定芽主要出現在愈傷組織團的邊緣和細胞團的中間位置，尤其以愈傷組織邊緣的居多。掃描電子顯微鏡的觀察顯示：產生愈傷組織的葉片數量＞出現類分生組織的葉片數量＞產生分生組織的葉片數量＞出現不定芽的葉片數量；單一葉片上出現類似趨勢：愈傷組織數量＞類分生組織數量＞分生組織數量＞不定芽數量。

圖1 黃金梨葉片不定芽再生過程的電鏡掃描Fig.1 Observation of adventitious bud regeneration process from leaves in P.pyrifolia Nakai using scanning electron microscope

2.2.2 不定根發(fā)生過程的掃描電鏡觀察

由葉片再生的長1～3cm的不定芽接種于生根培養(yǎng)基上，10d時可見不定芽基部出現少量愈傷組織，呈小顆粒狀或疣狀突起，部分疣狀的愈傷組織開始與周圍分離并形成一個空腔，最后形成基部與愈傷組織相連的柱狀結構(見圖2A )，此柱狀愈傷結構主要出現在不定芽基部所形成的愈傷組織中央(見圖2B)。愈傷組織表面形成一層膜狀結構，此時培養(yǎng)物轉入無激素低糖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。20d時柱狀愈傷結構慢慢伸長，突破膜的束縛，并切斷與周圍愈傷組織的聯系，從愈傷組織內部突出；30d時柱狀愈傷組織中央開始形成肉眼可見的小突起，此小突起細胞在電鏡下呈長方形，排列緊密，這些柱狀細胞團(小突起)可能是根的類分生組織(見圖2C)。當培養(yǎng)到40d，小突起繼續(xù)伸長，出現肉眼可見的不定根，根的數量要遠遠少于突起數量，一般僅3～4根(見圖2D)。電子顯微鏡下掃描不定根的根頸部橫切面發(fā)現細胞呈蜂窩狀(見圖2E)。50d左右不定根長1～2cm，應已完全形成，此時電子顯微鏡下成形的不定根粗壯，內部形成了細胞排列緊密的圓柱狀結構，根中部與根底部橫切面均為蜂窩狀(見圖2F)。

3 結論和討論

文中試驗結果表明，黃金梨葉片培養(yǎng)10d出現了愈傷組織，15d左右出現了類分生組織結構，40d左右出現不定芽，50d時成型的不定芽肉眼可見。在黃金梨葉片上所產生的成型不定芽數量遠少于電鏡可見的不定芽數量，而電鏡可見的不定芽數量也遠少于所形成的分生組織數量。長1～3cm的不定芽接種10d時基部產生愈傷組織，其上出現小突起，20d時形成根的類分生組織，30d時出現不定根的分生組織，40d時肉眼可見不定根，50d根長1～2cm，不定根主要產生在愈傷組織中央，數量與形成的類分生組織的數量相差很多。

掃描電鏡觀察雖發(fā)現接種的黃金梨葉片上有較多的類分生組織和分生組織形成，但葉片再生的頻率并不高[10]。洪維廉[11]等研究表明致密型愈傷組織處于形態(tài)發(fā)生的初級階段，預示著分化能力的開始產生，瘤狀愈傷組織細胞代謝活躍，細胞旺盛，具有較高的分化為器官的能力。黃金梨在接種15d后產生具有分化能力的致密愈傷組織，隨著時間的推移，致密愈傷組織細胞的活躍度增強、代謝強度加大，可逐步演變成具有分化為器官較高可能性的瘤狀愈傷組織，雖然瘤狀愈傷組織具備了器官再生的內部條件，但最終產生的不定芽的數目并不多，這與Zhu等[12]在野生梨葉片再生中觀察到的結果相似，Zhu等認為是培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基之間的差異或繼代次數過多出現分生組織脫分化所致。本試驗繼代次數不多，因繼代導致分生組織脫分化的機率較小，再生頻率不高極有可能是選用的培養(yǎng)基有利于葉片不定芽的誘導，而對不定芽的生長不利[8]；有利于不定芽生長的培養(yǎng)基種類還有待進一步探索。溫度、pH 值及光照條件[13]或外源物質如油菜素內酯[14]對葉片再生也有影響，是否對黃金梨葉片再生有影響還有待進一步證實。

圖2 黃金梨不定根再生過程的電鏡掃描Fig.2 Observation of adventitious root regeneration process in P.pyrifolia Nakai using scanning electron microscope

黃金梨葉片再生不定芽產生的不定根頻率較高，但并不表示可能出現較高的移栽成活率。包文泉[15]等研究認為，從不定芽基部愈傷組織誘導出的不定根，因愈傷組織的存在阻滯了莖與根之間輸導組織的暢通，導致養(yǎng)分和水分運輸的困難，從而導致試管苗移栽困難、成活率降低；本試驗中產生的不定根主要出現在愈傷組織中央，不定根與不定芽之間是否有維管束相連還有待進一步研究證實。

[1] 呂金陽,羅建舉.掃描電鏡下降香黃檀木材構造的研究[J].中南林業(yè)科技大學學報,2014,34(4):108-113.

[2] 王亞麗.利用掃描電鏡研究“南澳Ⅰ號”出水古木材的降解[J].中南林業(yè)科技大學學報,2013,33(6):48-54.

[3] 陳金慧,施季森,甘習華,等.雜交鵝掌楸體細胞胚胎發(fā)生的掃描電鏡觀察[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版),2005,29(1):75-78.

[4] 顧地周,高捍東,王艷萍,等.基于均勻設計優(yōu)化綬草體細胞胚胎發(fā)生發(fā)育體系及掃描電鏡觀察[J].華南農業(yè)大學學報,2010,31(1):60-64.

[5] Wang Ke-chen,Leng Chao,Huang Wen-gong,et al.Transmission electron microscopy Observation of different callus structures in Heiya No.14 [J].Agricultural Science＆technology,2009,10(4):125-127.

[6] 曾艷玲,張 琳,譚運德,等.云實葉片愈傷組織誘導中其酶活性及顯微結構變化[J].經濟林研究,2012,30(3):32-35.

[7] 杜 娟,王 罡.玉米自交系芽尖誘導再生植株的研究及掃描電鏡觀察[J].中國農業(yè)科學,2003,36(5):599-602.

[8] 曹 霞,柴明良.砂梨葉片再生不定梢[J].果樹學報,2005,22(5):557-560.

[9] 尹 婷.砂梨離體再生體系的建立及轉chit42基因的研究[D].長沙：湖南農業(yè)大學圖書館,2008.

[10] 陶愛群,尹 婷,謝深喜.黃金梨葉片再生體系建立研究[J].湖南農業(yè)科學,2012,5):108-111.

[11] 洪維廉,沈明山,郭 潔,等.中國水仙花梗組織培養(yǎng)及脫分化的電鏡觀察[J].廈門大學學報(自然科學版),1993,32(S):117-122.

[12] Zhu L H,Welander M.Adventitious shoot regeneration of two dwar fi ng pear rootstocks and the development of a transformation protocol [J].Journal of Horticulture Science,2000,75(6):745-752.

[13] 孫 俊.南果梨葉片離體培養(yǎng)的高效再生體系[J].江蘇農業(yè)科學,2014,42(3):44-46.

[14] 陳寶印,王彩虹,初慶剛,等.外源油菜素內酯對矮生梨試管苗莖、葉生長及解剖特性的影響[J].北方園藝,2014(11):7-11.

[15] 包文泉,鄒薇薇,朝洛蒙,等.歐洲花楸成熟種胚組織培養(yǎng)技術[J].經濟林研究,2013,31(2):91-95.