業(yè)曉青

（南京市江寧醫(yī)院兒科，江蘇南京211100）

兒童肺炎支原體檢測方法的研究進(jìn)展

業(yè)曉青

（南京市江寧醫(yī)院兒科，江蘇南京211100）

呼吸道感染是臨床常見疾病，病死率高，WHO2008年公布低收入國家下呼吸道感染病死率達(dá)11.2%，排十大疾病死因第一位，中高收入國家，病死率為3.8%，位居十大疾病死因的第四位［1］。支原體肺炎是機(jī)體感染肺炎支原體而引起的肺部炎癥，近年支原體肺炎的發(fā)病率出現(xiàn)逐年遞增趨勢［2］。肺炎支原體是常見的引起兒童呼吸道感染的病原體之一［3］，導(dǎo)致兒童社區(qū)獲得性肺炎（CAP）［45］。肺炎支原體引起的兒童肺炎病例在小兒呼吸道感染疾病中超過30%，發(fā)病有局部流行特點。由于初期臨床表現(xiàn)為非特異性癥狀，不易鑒別而被忽視造成累及多系統(tǒng)、器官損害的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒生命健康。實驗室指標(biāo)檢查是診斷衣原體感染的可靠依據(jù)。為加深對肺炎支原體的認(rèn)識，現(xiàn)將兒童肺炎支原體臨床檢測的研究進(jìn)展作一綜述。

1 肺炎支原體

支原體（Mycoplasma）是介于病毒和細(xì)菌之間的可以在無生命人工培養(yǎng)基中繁殖培養(yǎng)的一類缺少合成肽多糖基因的原核微生物，由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成三層結(jié)構(gòu)，中間層是脂質(zhì)，內(nèi)外兩層是蛋白質(zhì)，形成有分支的長絲，故于1967年稱之支原體，直徑0.2－0.3mm，極少超過1.0mm［6］。支原體廣泛存在于自然界，有60余種，有的支原體細(xì)胞膜外由多聚糖構(gòu)成有毒性的莢膜，是支原體的致病因素。對人致病的支原體有人型支原體、肺炎支原體、穿透支原體及解脲支原體［7］。肺炎支原體（Mycoplasma pneumoniae，MP）是Nocard和Roux于1898年首次從牛的肺組織中分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)的病原體［8］，1941年首次在非典型肺炎病人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)肺炎支原體［9］，無細(xì)胞壁，存在于病人的鼻腔、口腔和氣管粘膜，人與人之間經(jīng)飛沫或氣溶膠傳播，潛伏期一般為1－3周，5－15歲兒童易感染，主要表現(xiàn)為上呼吸道感染、氣管支氣管炎以及非典型肺炎，無地區(qū)分布特點，以溫帶地區(qū)常見［10］。美國文獻(xiàn)報道顯示肺炎支原體感染率介于2%－35%，有周期性特點，每隔4－7年有一次流行，5－9歲兒童感染肺炎支原體后發(fā)展為肺炎的機(jī)會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于15－19歲青少年［11］。我國徐作軍對肺炎支原體流行病學(xué)特點的有一完整描述：肺炎支原體全球范圍存在，一般為散發(fā)，3－6年可發(fā)生地區(qū)流行，人群密集地區(qū)集中發(fā)病；我國肺炎支原體引起的肺炎發(fā)病率高于國外地區(qū)；在中國，肺炎支原體肺炎有季節(jié)性特點，秋冬季發(fā)病率高；青壯年多發(fā)肺炎支原體肺炎［12］。國內(nèi)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，散發(fā)年份，肺炎支原體感染是兒童肺炎病原的10%－20%，流行年則可達(dá)到30%以上［13］。

2 發(fā)病機(jī)理及臨床表現(xiàn)

肺炎支原體主要侵犯人體呼吸系統(tǒng)，病理表現(xiàn)間質(zhì)性或局灶性肺炎，常位于右肺下葉，累及多肺葉和胸膜，引起咽炎、氣管炎、支氣管炎和肺炎［14］。

肺炎支原體感染引起的兒童肺炎大部分為5－15歲的少年，偶然可能會在5歲以下兒童中發(fā)生?；純撼跗诎Y狀不明顯，2－3周后癥狀加重，表現(xiàn)為干咳、嚴(yán)重者伴有喘息和呼吸困難，少數(shù)患病兒童肺炎發(fā)展迅速，發(fā)生呼吸衰竭或急性呼吸窘迫綜合征而死亡［15］。另有研究報道，肺炎支原體感染也許是哮喘發(fā)生、發(fā)展的風(fēng)險因素?？紤]肺炎兒童自身對肺炎支原體來說是敏感人群，肺炎支原體具備促進(jìn)呼吸道炎癥，加重哮喘癥狀以及延長其病程［16－17］。

3 實驗室檢測

肺炎支原體感染的肺炎近年發(fā)病率持續(xù)升高，耐藥性不斷增加，探討早期、快速檢測肺炎支原體方法非常重要。臨床檢測肺炎支原體的方法有培養(yǎng)法、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)技術(shù)。目前普遍采用的肺炎支原體分離培養(yǎng)與血清學(xué)方法敏感性差，特異度低，試驗時間長，常出現(xiàn)假陰性結(jié)果。PCR診斷技術(shù)具有較高的靈敏度和特異度，為建立可靠快速的肺炎支原體早期檢測提供了可能。

3.1 培養(yǎng)法

采集臨床疑似患兒的咽拭子、痰、胸腔積液和肺泡沖洗液做標(biāo)本，選擇疑似菌落超高倍顯微鏡做肺炎支原體活體檢測。肺炎支原體分離培養(yǎng)是檢測病原體的方法之一，方法操作簡單，但臨床標(biāo)本的病原體含量少，分離培養(yǎng)時間耗時長，一般為3－4周時間，陽性結(jié)果靈敏度低，早期診斷價值?。?8］。

3.2 血清學(xué)檢測

血清學(xué)檢測是臨床常用作診斷肺炎支原體感染的方法之一，包括抗原檢測和抗體檢測兩類方法?？乖瓩z測法主要包括直接免疫熒光法、對流免疫電泳法、蛋白質(zhì)印跡法和抗原捕獲酶聯(lián)免疫分析方法；抗體檢測方法中的酶聯(lián)免疫吸附試驗和明膠顆粒凝集試驗方法應(yīng)用廣泛。相對于抗體檢測肺炎支原體感染，抗原檢測方法靈敏度低，容易與呼吸道其他支原體出現(xiàn)交叉反應(yīng)，臨床應(yīng)用受限，故臨床抗體檢測應(yīng)用普遍［19］。目前臨床研究進(jìn)展顯示血清學(xué)特異性抗體檢測是診斷肺炎衣原體感染的主要手段［20］?，F(xiàn)介紹幾種臨床常用的血清學(xué)檢測方法。

3.2.1 血清冷凝集試驗（Cold agglutination test，CAT） 是肺炎支原體感染時最早的一種體液反應(yīng)，一般發(fā)生在感染肺炎支原體的一周后期或第二周前期，血清冷凝集效價升高。臨床常作為診斷肺炎支原體感染的傳統(tǒng)血清學(xué)檢測方法，因為操作方法簡單，基層醫(yī)院可作為有參考價值的診斷方法。但該方法的靈敏度和特異度不高，不能作為肺炎支原體感染的確診指標(biāo)［21－22］。

3.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme Immunoassay，ELISAFA法） 上世紀(jì)80年代發(fā)明，常用作肺炎支原體抗體檢測。原理是采用吸附于載體表面的抗原，與血清中的相應(yīng)抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物，與酶標(biāo)記的第二抗體結(jié)合發(fā)生免疫反應(yīng)，借助酶的降解作用顯示的不同顏色作出診斷。該方法試驗過程需要1小時，對實驗室條件沒有養(yǎng)要求，臨床較容易開展。缺點就是檢測結(jié)果受年齡、疾病病程，機(jī)體免疫功能及試劑盒不同等方面的影響，故不能對肺炎支原體早期診斷提供有力依據(jù)［23－24］。

3.2.3 明膠顆粒凝集法（PA） 將待檢標(biāo)本血清稀釋，加入明膠致敏顆?；靹颍瑱z測其結(jié)果。該試驗方法操作簡單、方便快捷，血清抗體特異度高，無假陽性結(jié)果，符合率高，是臨床早期診斷衣原體肺炎感染的特異性方法之一，是支原體肺炎實驗室診斷的常規(guī)檢測方法［25］。

3.2.4 血清學(xué)檢測結(jié)果不能避免患兒的假陽性和假陰性問題，感染肺炎支原體肺炎的兒童，臨床治療治愈后體內(nèi)仍存有一定強(qiáng)度的抗體滴度，接受抗體檢測時會出現(xiàn)假陽性；或者免疫缺陷不產(chǎn)生抗體的患兒，或免疫力低下的兒童自身抗體滴度低，檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性而失去臨床治療的機(jī)會［2627］。所以對于免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟或存在免疫缺陷的兒童病例，血清學(xué)檢測有一定的局限性。

3.3 分子生物學(xué)診斷技術(shù)

1985年P(guān)CR診斷技術(shù)問世以來，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各領(lǐng)域［28］。該診斷技術(shù)的標(biāo)本采集及培養(yǎng)的過程大概需要2個小時，能夠檢測出患兒咽喉分泌物里的支原體DNA，文獻(xiàn)報道采用PCR技術(shù)檢測標(biāo)本中的肺炎支原體，140例標(biāo)本中30例標(biāo)本PCR試驗陽性，其中21例肺炎支原體抗體陰性，有較高的靈敏度，并且實驗時間短［26］，檢測病原體表現(xiàn)出的快速簡單，靈敏度、特異度高的優(yōu)點，遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于其他檢測方法，具有較高的臨床價值，可作為早期診斷肺炎支原體感染的方法［29］。張曉波等采用熒光定量法PCR技術(shù)檢測肺炎支原體，發(fā)現(xiàn)該方法針對免疫系統(tǒng)發(fā)育未成熟的患兒具有一定診斷價值，但是單獨診斷的準(zhǔn)確率低于血清學(xué)檢測結(jié)果［3032］。如果從鼻咽、口咽處同時取標(biāo)本做PCR檢測，診斷結(jié)果更可靠［33］。帶痰患兒的痰標(biāo)本PCR陽性率高于鼻咽標(biāo)本的PCR陽性率，臨床診斷下呼吸道感染情況更敏感［34］。但是PCR診斷技術(shù)操作復(fù)雜，所使用的一起設(shè)備較昂貴，基層醫(yī)院和一般實驗室開展不了該技術(shù)工作。

4 展望

綜上所述，肺炎支原體感染診斷方法很多，并各有其優(yōu)點和不足。臨床選擇合適的實驗檢測方法，能夠早期快速診斷肺炎支原體感染，及時提供準(zhǔn)確的治療方案，減少并發(fā)癥及耐藥菌的產(chǎn)生。目前臨床針對患者癥狀體征和具體用藥方案選擇PCR生物技術(shù)聯(lián)合血清學(xué)方法檢測肺炎支原體是較可靠的診斷方法。專家學(xué)者也在不斷研究新的肺炎支原體感染診斷檢測方法，隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步加深了解肺炎支原體發(fā)病機(jī)理和耐藥機(jī)制，不斷更新檢測技術(shù)，肺炎支原體的實驗室檢測方法將會具備更加早期、快速，特異性強(qiáng)、高效的特色。

［1］Onozuka D，Hashizume M，Hagihara A.Impact of weather factors on Mycoplasma pneumoniae pneumonia［J］.Thorax，2009，64（6）：5077.

［2］陳學(xué)高.小兒支原體肺炎的診治進(jìn)展［J］.臨床肺科雜志，2011，（16）8：1246.

［3］Yang E，Altes T，Anupindi SA.Early Mycoplasma pneumoniaeinfection presenting as multiple pulmonary masses：an unusual prewentation in a child［J］.Pediatr Radiol，2008，38（4）：477.

［4］Tamura A，Matsubara K，Tanaka T，etal.Methylprednisolone pulse therapy for refractory Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children［J］.J Infect，2008，57（3）：223.

［5］Kinm NH，Lee JA，Eun BW，etal.Comparison of polymerase chain reaction and the indirect particle agglutination antibody test for the diagnosis of Mycoplasma pneumoniae pneumonia in children during two outbreaks［J］.Pediatr Infect Dis J，2007，26（10）897.

［6］Himmelreich R，Hilbert H，Plagens H，et al.Complete sequence analysis of the genome of the bacterium Mycoplasma pneumoniae［J］.Nucleic Acids Res，1996，24：4420.

［7］Waites KB，Katz B，Schelonka RL.Mycoplasmas and ureaplasmas as neonatal pathogens［J］.Clin Microbiol Rev，2005，18：757.

［8］Parmley EJ，Bastien N，Booth TF，et al.Wild bird influenza survey，Canada，2005［J］.Emerg Infect Dis，2008，14（1）：84.

［9］Eaton MD，Bedk MD，Pearson HE.A virus from cases of atypical pneumonia：relation to the viruses of meningopneumonitis and psittacosis［J］.J Exp Med，1941，73：641.

［10］Lin WC，Lee PI，Lu CY，et al.Mycoplasma pneumoniae encephalitis in childhood［J］.J Microbiol Immunol Infect，2002，35：173.

［11］Meyers LA，Newman ME，Martin M，et al.Applying network theory to epidemics：control measures for Mycoplasma pneumoniae outbreaks［J］.Emerg Infect to epidemics：control measures for Mycoplasma pneumoniae outbreaks［J］.Emerg Infect Dis，2003，9：204.

［12］徐作軍.《成人肺炎支原體肺炎診治專家共識》淺析［J］.中國實用內(nèi)科雜志，2010，30（12）：1116.

［13］林美玲，陳美蓮，陳忠城.小兒呼吸道肺炎支原體感染流行病學(xué)分析［J］.實用醫(yī)技雜志，2006，13（16）：2901.

［14］王軍華，王振先.小兒肺炎支原體感染診治研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2013，1（19）：78.

［15］王娟，張晗，劉春峰，等.兒童重癥肺炎支原體肺炎合并急性呼吸窘迫綜合征三例［J］.中國小兒急救醫(yī)學(xué)，2011，18（5）：475.

［16］蘇海燕，金尾靜，張海鄰，等.支原體肺炎合并肺栓塞一例臨床分析［J］.中華兒科雜志，2012，50（2）：151.

［17］尚云曉.肺炎支原體感染與兒童哮喘［J］.中國實用兒科雜志，2011，26（4）：250.

［18］王貴年，馬進(jìn)強(qiáng)，蘇艾云.肺炎支原體感染的實驗室診斷進(jìn)展［J］.診斷學(xué)理論與實踐，2009，8（4）：458.

［19］孫 煒，趙 勇.四種抗肺炎支原體抗體檢測方法應(yīng)用比較［J］.醫(yī)學(xué)檢驗與臨床，2007，18（5）：34.

［20］張冬雪，劉 雙.肺炎支原體感染的實驗室研究進(jìn)展［J］.臨床肺科雜志，2011，16（2）：241.

［21］BA Cunha.The clinical diagnsis of Mycoplasma pneumoniae：the diagnostic importance of highly elevated serum cold agglutinins［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，2008，27：1017－1019.

［22］Andreu LM，Molinos AS，F(xiàn)ernandez RG，et al.Serologic diagnosis of Mycoplasma pneumoniae infections［J］.Enferm Infect Microbiol Clin，2006，24（Suppl 1）：19.

［23］吳躍平，趙瑞珍.小兒肺炎支原體感染IgM抗體檢測分析［J］.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，27（7）：656.

［24］季 偉，陳正榮，張愛麗，等.熒光PCR和定量ELISA在呼吸道肺炎支原體感染診斷中的應(yīng)用［J］.臨床兒科雜志，2009，27（7）：625.

［25］Gouriet F，Levy PY，Samson L，et al.Comparison of the new Inddiag autonmated fluorescence multiplexed an tigen microarrsy to the reference technique in the semdiagnosis of atepical bacterial pneumonia［J］.Clin Mierobiol Infect，2008，14（12）：1119.

［26］LIU Chun－ling，WANG Gui－qiang，ZHANG Bo，et al.Mycoplas－ma pneumoniae pneumonia in hospitalized children diagnosed at acute stage by paired sera.Chin Med J，2010，123（23）：3444.

［27］盧志威，趙 輝，鄭躍杰.三種方法對兒童肺炎支原體感染診斷的動態(tài)評價［J］.臨床兒科雜志，2012，30（4）：382.

［28］齊振勇，齊振水，MP DNA檢測對小兒支原體肺炎的診斷價值［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48（7）：70.

［29］龐寶軍.肺炎支原體實驗室檢測方法進(jìn)展及其臨床應(yīng)用［J］.臨床肺科雜志，2004，9（5）：515.

［30］陳則文，黃建萍.小兒肺炎支原體肺炎的相關(guān)檢查［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2011，17（14）：2139.

［31］張曉波，陸愛玲，王立波，等.肺炎支原體熒光定量法聚合酶鏈反應(yīng)在肺炎支原體感染中的診斷評價［J］.中華兒科雜志，2008，46（6）：442.

［32］張永明，劉秀云.肺炎支原體肺炎及其并發(fā)癥的診治進(jìn)展［J］.中國當(dāng)代兒科雜志，2011，13（4）：358.

［33］4種肺炎支原體檢驗方法的臨床應(yīng)用［J］.檢驗醫(yī)學(xué)與臨床，2012，9（22）：2852.

［34］任 翔，李靜宜，田秀君，等.肺炎支原體感染認(rèn)識新進(jìn)展［J］.中國病原生物學(xué)雜志，2012，（7）7：550.

業(yè)曉青（1969－），女，江蘇人，本科，副主任醫(yī)師，長期從事兒內(nèi)科的研究臨床工作。

2013－11－14）

1007－4287（2014）10－1729－03