，，，，

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150000；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

禽流感診斷和監(jiān)測(cè)拭子樣品的采集、運(yùn)輸和保存

張笑春1，劉 朔2，莊青葉1，黃保續(xù)2，陳繼明2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱150000；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島266032）

禽流感拭子樣品的采集、運(yùn)輸和保存對(duì)禽流感病原學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)很重要。本文介紹了這方面的國(guó)際和國(guó)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)，分析了近年來這方面研究進(jìn)展，最后總結(jié)出較優(yōu)的禽流感診斷和監(jiān)測(cè)拭子樣品采集、運(yùn)輸和保存方法，以期為我國(guó)禽流感病原學(xué)診斷和監(jiān)測(cè)提供參考。

禽流感；拭子樣品；采集；運(yùn)輸；保存

禽流感病毒是一類重要的病原，能夠引起家禽大量發(fā)病和死亡。有些禽流感病毒還能感染人，引起人發(fā)病死亡。例如，2013年中國(guó)出現(xiàn)的H7N9型禽流感已經(jīng)引起300多個(gè)人間病例，其中約有1/3為死亡病例。禽流感病毒具有亞型多和變異快的特點(diǎn)，使禽流感防控難度極大。開展禽流感病原學(xué)監(jiān)測(cè)，快速和準(zhǔn)確地檢測(cè)禽流感病毒感染，對(duì)于禽流感防控工作極為重要。在禽流感病毒檢測(cè)和監(jiān)測(cè)過程中，采集、運(yùn)輸和保存可能帶有禽流感病毒的宿主咽喉拭子、泄殖腔拭子、糞便或環(huán)境拭子樣品。這些過程會(huì)影響實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的靈敏度。近年來，在禽流感拭子樣品的采集、運(yùn)輸和保存方面的研究取得了一些進(jìn)展，現(xiàn)就這些研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，如下：

1 樣品采集

1.1 拭子類型

根據(jù)拭子材料和制作工藝的不同，目前主要有普通醫(yī)用棉簽、聚酯纖維拭子、聚丙烯纖維拭子、聚乙烯棉簽、尼龍（聚酰胺纖維）植絨拭子、聚氨酯泡沫拭子和非植絨滌綸拭子等。植絨（focked）是利用電荷的自然特性產(chǎn)生的一種生產(chǎn)新工藝，其原理是利用電荷同性相斥異性相吸的物理特性，使絨毛帶上負(fù)電荷，把需要植絨的物體放在零電位或接地條件下，絨毛受到異電位靶物體的吸引，呈垂直狀加速飛升到靶物體表面上，由于靶物體涂有膠粘劑，絨毛就被垂直粘在靶物體上。如今對(duì)禽流感病毒進(jìn)行檢測(cè)和監(jiān)測(cè)，常用的樣品采集拭子主要是以脫脂棉為原材料制成的醫(yī)用棉簽。

WHO推薦采集人喉鼻拭子時(shí)選用聚酯纖維拭子[1]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（CNICSOP07001）建議采集人呼吸道樣品時(shí)選用聚丙烯纖維頭拭子[2]；我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 765-2004）規(guī)定采集禽糞便或泄殖腔拭子樣品時(shí)，可使用棉質(zhì)、聚乙烯或滌綸材質(zhì)的滅菌棉簽，但所采集樣品用于病毒核酸定量檢測(cè)時(shí)則最好選用滌綸材質(zhì)的滅菌棉簽[3]。

Fereidouni SR等[4]曾用尼龍植絨和人造纖維兩種類型拭子采集禽流感樣品，運(yùn)用real-time RTPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)比發(fā)現(xiàn)兩種拭子產(chǎn)生相似的Ct值，適用性相同。Spackman E等[5]分別采用尼龍植絨、非植絨滌綸（聚酯纖維）和聚氨酯泡沫等三種類型的拭子，采集雞禽流感和新城疫樣品，并利用病毒分離、real-timeRT-PCR和商業(yè)抗原檢測(cè)分析的方法對(duì)其進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)尼龍植絨和聚氨酯泡沫拭子的效果優(yōu)于非植絨滌綸拭子，能夠更好捕捉大量樣品并將其釋放到采樣液中。Killian ML[6]對(duì)棉簽柄的材質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)木柄表面物質(zhì)會(huì)影響病毒活性，抑制病毒核酸分離，影響檢測(cè)結(jié)果，因此建議采集禽流感拭子樣品時(shí)使用塑料柄聚酯棉簽。此外，已經(jīng)證實(shí)醫(yī)學(xué)常用的生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定劑——海藻糖不適合處理拭子，該物質(zhì)會(huì)使病毒失活，病毒滴度在48h內(nèi)會(huì)降低1000倍[7]。

1.2 采樣保存液

采集禽流感拭子樣品所用的采樣保存液一般由用于培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)菌的基礎(chǔ)緩沖液、平衡鹽溶液或蛋白緩沖液及抗生素組成。根據(jù)采集樣品的不同，采樣保存液中使用的抗生素種類及用量可進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

WHO推薦配方：小牛浸液肉湯10g 、牛血清白蛋白V 2g、無菌蒸餾水400 mL、硫酸慶大霉素溶液（50 mg/mL）0.8 mL、兩性霉素B（250μg/L）3.2mL。該采樣保存液適用于收集人的喉、鼻拭子[1]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（CNICSOP07001）推薦配方：①呼吸道樣品保存液：Hank’s/MEM液（pH 7.4-7.6）400 mL、慶大霉素（50 mg/mL）0.8 mL、多粘菌素B（250 μg/mL）3.2 mL；②糞便樣品保存液：1L MEM 中加入7.5%牛血清白蛋白V、青霉素、鏈霉素、慶大霉素、多粘菌素B、制霉菌素和氧氟沙星，使終濃度分別達(dá)到0.5%、2×106U/L、200 mg/L、250 mg/L、2×106U/L、50μg/mL和60 mg/L[2]。調(diào)節(jié)pH至7.4，分裝2～3 mL/管，-20℃凍存。

OIE和我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 765-2004）均建議保存禽咽喉拭子、泄殖腔拭子和糞便拭子樣品采用加有抗生素的等滲PBS （0.01 mol/L，pH 7.4）作為采樣保存液。配方如下：每1L含NaCL 8.0g、KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、KCL 0.2g。調(diào)pH至7.4，高壓滅菌后，于4℃?zhèn)溆谩Ｎ覈?guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)建議加入抗生素及濃度：青霉素（2000 IU/mL）、鏈霉素（2 mg/mL）、丁胺卡那霉素（1000 IU/mL）、制霉菌素（1000 IU/mL）；除慶大霉素（50 μg/mL）替代丁胺卡那霉素外，OIE建議采樣保存液抗生素種類及用量與農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一致。喉氣管和口咽拭子加入上述濃度抗生素的保存液即可，糞便和泄殖腔拭子所需抗生素濃度應(yīng)提高5倍[3，8]。美國(guó)國(guó)家獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室（NVSL）采集禽氣管和泄殖腔拭子樣品時(shí)使用不含抗生素的BHI （Brain heart infusion）肉湯作為采樣保存液（這些樣品既可用于病毒的分離，也可用于細(xì)菌的分析），同時(shí)也建議使用蛋白緩沖液，如胰蛋白胨或蛋白胨肉湯等，其中蛋白可防止病毒降解，增加病毒穩(wěn)定性[6]。Spackman E等[5]針對(duì)禽流感和新城疫拭子樣品，采用病毒分離、real-time RT-PCR和商業(yè)抗原檢測(cè)分析的方法，對(duì)BHI和PBS采樣保存液進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)BHI比PBS效果好?？紤]到成本等諸多方面問題，國(guó)內(nèi)對(duì)活禽進(jìn)行禽流感拭子樣品采集時(shí)，普遍使用我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)推薦的采樣保存液。然而，采集人的咽拭子或肛門拭子時(shí)，則多使用國(guó)標(biāo)推薦的采樣保存液。

2 樣品運(yùn)輸和保存

2.1 運(yùn)輸方式

如何運(yùn)輸采集的拭子樣品，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)并沒有對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)說明。Spackman E等[5]將禽流感和新城疫拭子樣品，分別使用濕拭子運(yùn)輸、干拭子運(yùn)輸和運(yùn)輸前將拭子從采樣保存液中取出這三種運(yùn)輸方式，用病毒分離、real-time RT-PCR和商業(yè)抗原檢測(cè)分析的方法進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明濕拭子運(yùn)輸比干拭子運(yùn)輸效果好，在運(yùn)輸前是否移除拭子，對(duì)病毒的檢測(cè)沒有明顯影響。Killian ML[6]認(rèn)為干拭子運(yùn)輸會(huì)降低禽流感病毒的分離率，建議采用濕拭子運(yùn)輸。Roelandt S等人[9]采集北京鴨的口咽和泄殖腔拭子，并采用運(yùn)輸干、濕拭子兩種方式，利用RTPCR方法進(jìn)行病毒檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)口咽拭子采用濕拭子運(yùn)輸效果較好；泄殖腔拭子則采用干拭子運(yùn)輸效果較好；但兩種運(yùn)輸方式對(duì)禽的定性檢測(cè)沒有影響。

2.2 溫度

溫度是影響禽流感拭子樣品運(yùn)輸和保存的主要因素。樣品運(yùn)輸和保存過程中，能否保持病毒活性，對(duì)禽流感檢測(cè)是非常重要的。

WHO規(guī)定：樣品進(jìn)行病毒分離檢測(cè)時(shí)，4℃可以保存2天，超出2天則需置于-70℃保存；干冰冷藏運(yùn)輸時(shí)，干冰需密閉包裝，以防止揮發(fā)出的CO2影響病毒活性[10]。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（CNICSOP07001）要求樣品短途運(yùn)輸可加冰保冷，長(zhǎng)途運(yùn)輸需加干冰。糞便樣品檢測(cè)方式不同，推薦的保存溫度也不同，如，進(jìn)行病毒核酸檢測(cè)時(shí)推薦保存溫度為-70℃、-20℃和4℃，7天以內(nèi)也可室溫保存；進(jìn)行病毒分離實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議-70℃保存，4天以內(nèi)也可置于4℃保存[2]。我國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（NY/T 765-2004）建議樣品在4h以內(nèi)采用冰袋運(yùn)輸，若4～24h內(nèi)能送至實(shí)驗(yàn)室可-30℃冷凍再用保溫箱加冰袋運(yùn)輸，〉24h送至實(shí)驗(yàn)室，則應(yīng)在-20℃以下保存運(yùn)輸。若送至實(shí)驗(yàn)室，不進(jìn)行樣品處理，應(yīng)在-70℃或更低溫度下保存，避免反復(fù)凍融[3]。OIE推薦長(zhǎng)期儲(chǔ)存樣品的最佳溫度為-140℃，-80℃或-20℃可以保存樣品5～10年[11]。

Dundon WG等[12]將瓶裝凍干禽流感抗原和抗血清制劑置于4℃、22℃和37℃保存，并選取第0、3、7、14和21天分別進(jìn)行HA、HI和瓊擴(kuò)試驗(yàn)。結(jié)果表明，凍干的禽流感抗原在4℃和22℃保存21天仍存在血凝活性；用于瓊擴(kuò)試驗(yàn)的抗原和抗體在4℃和37℃保存21天可維持穩(wěn)定。Fereidouni SR等人[4]證實(shí)，禽流感拭子樣品在4℃和20℃恒溫可保存兩周，但溫度變化對(duì)病毒的影響很大。Killian ML[6]建議不要在0℃保存樣品，以盡量避免反復(fù)凍融；拭子樣品可在4℃保存一周，-20℃或更低溫度下可保存幾周到數(shù)月。

3 結(jié)論

目前，禽流感監(jiān)測(cè)方法已經(jīng)建立，并成功應(yīng)用于許多國(guó)家。但是，針對(duì)禽流感拭子樣品采集、運(yùn)輸和保存這方面的內(nèi)容很少，沒有足夠的文獻(xiàn)支持，且采集方法標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，常根據(jù)家禽種類、監(jiān)測(cè)目標(biāo)以及材料的成本而發(fā)生變化，而統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)采樣方法可以使禽流感監(jiān)測(cè)更加準(zhǔn)確。本文參考現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合前人實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為采集禽流感拭子樣品適宜選擇塑料柄的尼龍植絨、聚氨酯泡沫、人造纖維拭子，建議使用BHI作為采樣保存液，采用濕拭子運(yùn)輸，可用干冰冷藏運(yùn)輸。此外，樣品可在4℃保存2天；超出2天置于-20℃可保存一周至數(shù)月；-70℃可保存5～10年。且盡量避免反復(fù)凍融。

[1] World Health Organization. WHO guidelines for the collection of human specimens for laboratory diagnosis of avian infuenza infection[J]. GENEVA：WHO，2005.

[2] 張燁，薄洪. CNICSOP07001，國(guó)家流感中心標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（修訂版）[S] 北京：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒預(yù)防控制所，2007.

[3] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. NY/T 765-2004 高致病性禽流感樣品采集、保存及運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范[S]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2004-02-17.

[4] Fereidouni S R，Globig A，Starick E，et al. Effect of Swab Matrix，Storage Time，and Temperature on Detection of Avian Infuenza Virus RNA in Swab Samples[J]. Avian diseases，2012，56（4s1）：955-958.

[5] Spackman E，Pedersen J C，McKinley E T，et al. Optimal specimen collection and transport methods for the detection of avian infuenza virus and Newcastle disease virus[J]. BMC veterinary research，2013，9（1）：35.

[6] Mary Lea Killian BS M S. Avian influenza virus sample types，collection，and handling[M] Avian Influenza Virus. Humana Press，2008.

[7] Johnson F B. Transport of viral specimens[J]. Clinical microbiology reviews，1990，3（2）：120-131.

[8] Manual O I E T. Chapter 2.3. 4.—Avian infuenza[J]. 2009.

[9] Roelandt S，Outtrim L，Browning C，et al. Evaluation of two different swab transport systems in the detection of avian influenza virus excretion from infected Pekin ducks （Anasplatyrhynchos）[J]. Journal of virological methods，2012，184（1）：8-14.

[10] World Health Organization. WHO laboratory biosafety guidelines for handling specimens suspected of containing avian infuenza A virus[J]. GENEVA：WHO，2005.

[11] Offce International Des Epizooties. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals[M]. 7th ed. PARIS：OIE，2012.

[12]Dundon W G，Boscarato L，Mazzacan E，et al. Effect of different temperatures on the stability of avian infuenza reference reagents[J]. Avian diseases，2007，51（s1）：366-369.

Collection，Transportation and Preservation of Swab Samples for Diagnosis and Surveillance of Avian Infuenza

Zhang Xiaochun1，Liu Shuo2，Zhuang Qingye1，Huang Baoxu2，Chen Jiming2

（1. Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang 150000；
2.China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao 266032）

Collection，transportation and preservation of swab samples are important for the diagnosis and surveillance of avian infuenza. The international and national standards and some recent researches in this feld were reviewed here，and the optimal methods were proposed for collection，transportation and preservation of swab samples for diagnosis and surveillance of avian infuenza，so as to provide reference for the diagnosis and surveillance of avian infuenza.

Avian infuenza； Swab samples；Collection；Transportation；Preservation

S855.3 < class="emphasis_bold">文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

A

1005-944X（2014）07-0030-04

陳繼明