錢偉鋒，閆文朝，韓利方，王天奇

弓形蟲是一種專性有核細胞內(nèi)寄生的原蟲，能夠感染人和所有的溫血動物，對人和動物的健康均存在嚴重的威脅。文獻報道，世界上約有1/3的人呈慢性感染，弓形蟲感染能夠引起孕婦和懷孕動物的流產(chǎn)、胎兒畸形等；引起免疫抑制病人或動物的腦炎、急性弓形蟲病等，嚴重時甚至導致死亡[1]。目前，已知弓形蟲僅有一個種，但存在著不同的基因型。除典型的I型、II型和III型外，還有至少138個非典型基因型(www.toxodb.org)。世界范圍內(nèi)，弓形蟲基因型的分布具有地域性[2]，國內(nèi)有關(guān)弓形蟲分型的研究相對較少。最初根據(jù)弓形蟲對小鼠的致病力，將其分為高致病力(如I型)和低致病力(II型和III型)蟲株[3]；后來，學者們逐漸發(fā)現(xiàn)了多個用于弓形蟲基因型鑒定的遺傳標記，并建立了多種基因型鑒定的方法，如多位點測序法、PCR-RFLPs、微衛(wèi)星法等，隨著研究的深入，這些方法被逐漸地發(fā)展和完善，對弓形蟲的分子流行病學研究及弓形蟲病的防控有著重要意義。為此，本文對弓形蟲基因型的鑒定方法進行了總結(jié)，為更好地選擇合適的分型方法等提供參考。

1 多位點測序分型法

多位點測序分型法(multilocus sequence typing，MLST)是建立在DNA序列多態(tài)性的基礎(chǔ)之上，對擴增的DNA序列進行測序來檢測序列內(nèi)單核苷酸的多態(tài)性(SNPs)。SNPs是指基因組DNA序列中由于單個核苷酸(A，G，C，T)替換而引起的多態(tài)性，它是一種單核苷酸的變異，SNPs被認為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變，可用于群體遺傳學中關(guān)于生物起源、進化和遷移等方面的研究。

SNPs是基因組中最常見、分布最廣泛的DNA多態(tài)性類型?；蚪M中每1kb就有1個以上的SNPs，因此整個基因組中SNPs非常豐富。在基因組DNA中，任何堿基均有可能發(fā)生變異，因此SNP既有可能在基因序列內(nèi)，也有可能在基因以外的非編碼序列上。在弓形蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的SNPs有的位于編碼蟲體表面的抗原及細胞器抗原的基因內(nèi)[4-5]；有的位于編碼弓形蟲結(jié)構(gòu)蛋白的基因內(nèi)，如α-微管蛋白、β-微管蛋白和肌動蛋白[6]；有的位于編碼某些酶的基因內(nèi)，如二氫葉酸還原酶和合成酶、胸腺嘧啶合成酶、DNA聚合酶α等[7-8]；還有一些位于未知功能的基因內(nèi)，如850、950、L328、C19和B1基因等[9-10]。到目前為止，至少已發(fā)現(xiàn)250個SNPs生物學標記，核苷酸總長度達到300 kb，貫穿了弓形蟲的14條染色體。這些標記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于研究弓形蟲的遺傳多樣性研究，并且對研究弓形蟲的表型特點(如弓形蟲毒力相關(guān)基因)等有很重要意義。該方法具有很高的分辨率和準確性，但是大量的擴增和測序需要有充足的樣本，并且耗時，成本也比較高。

2 聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性分析法

聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長度多態(tài)性分析法(Polymerase Chain Reaction- Restriction Fragment Length Polymorphism，PCR-RFLP)也是檢測DNA序列內(nèi)單核苷酸的多態(tài)性(SNPs)，但只檢測內(nèi)切酶識別位點內(nèi)的SNPs，該方法是對傳統(tǒng)RFLP的一種改進。首先采用PCR技術(shù)擴增出一段特定的DNA序列，再用限制性內(nèi)切酶酶切此段序列，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，通過片段長度的多態(tài)性來判讀比對不同來源基因序列的差異性[10]。與測序方法相比，PCR-RFLP檢測結(jié)果的信息含量比較少。例如，F(xiàn)azaeli等通過測序弓形蟲高多態(tài)性基因GRA6將弓形蟲30個分離株分為9個組，通過PCR-RFLP的方法卻只能夠?qū)⑵浞譃?個組[5]。盡管這樣，PCR-RFLP仍然是目前用于弓形蟲分型最為常用的的方法，因為通過該方法可方便、快速、大量地分析弓形蟲的基因型特點。

最常用于弓形蟲基因分型的特異性標記是SAG2基因，主要是通過對該基因的兩個限制性酶切位點進行PCR-RFLP分析，基于該方法，Howe等首次將弓形蟲劃分為3個典型基因型I～III[11]。早期的很多研究完全依靠SAG2基因?qū)蜗x進行分型，但是僅用SAG2一個基因?qū)蜗x進行分型的能力是有限的，特別是對于重組的或者非典型弓形蟲。于是后來就發(fā)展了多位點的PCR-RFLP的基因分型方法。

多位點的PCR-RFLP是選擇多個含SNPs的基因進行PCR-RFLP的方法，該方法后來被廣泛應(yīng)用于弓形蟲分子流行病學研究，并且隨著研究的深入，多位點分析法也在不斷的發(fā)展和完善，并且被大量用于弓形蟲DNA多態(tài)性分析中。早在1995年，Howe和Sibley采用6個位點的PCR-RFLP方法調(diào)查分析了來自北美和歐洲西部的106株弓形蟲，結(jié)果顯示這些蟲株主要屬于3個基因型，分別是type I、type II 和 type III，其中只有4個分離株表現(xiàn)為 type I與 type II的重組或者 type II 與 type III 的重組基因型，由此推斷弓形蟲可能為單克隆系的種群結(jié)構(gòu)[10]。后來，又有學者采用不同的多位點PCR-RFLP或微衛(wèi)星分析法對來自其它不同地區(qū)的弓形蟲株進行了流行病學和種群結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，南美洲弓形蟲株具有高度多樣性，大多數(shù)是重組型弓形蟲，與歐洲、北美的分離株有很大的差別[12-13]。

由于不同實驗室選用的基因位點不盡一致，因此分型結(jié)果很難放在一起比較；另外，用于分型的多數(shù)基因為單拷貝基因，故當樣品量少、DNA含量低，特別是臨床或?qū)嶒灲M織樣品，該方法的敏感性就比較差。為解決上述問題，Dubey等2007年建立了針對10個遺傳標記的多重多位點巢式PCR-RFLP (Mn-PCR-RFLP)方法[14]，這10個遺傳標記包括SAG1，SAG2 alt. SAG2 ，(3′+5′)SAG2，SAG3，BTUB，GRA6，c22-8，c29-2，L358，PK1 和Apico。該方法首先利用外引物通過多重PCR方法擴增目的片段，再利用內(nèi)引物進行巢式PCR分別擴增目的基因，最后酶切、電泳后對酶切圖譜進行比對分析。與傳統(tǒng)的PCR-RFLP相比，該方法的敏感性大大提高，檢測限為10個弓形蟲，傳統(tǒng)的PCR-RFLP檢測限是100個。另外，多重PCR也節(jié)約了大量的時間。目前，Mn-PCR-RFLP分析法已經(jīng)廣泛應(yīng)用于弓形蟲的基因分型，并且獲得了大量有關(guān)弓形蟲遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu)等方面的數(shù)據(jù)[13-14]。

3 微衛(wèi)星分析法

微衛(wèi)星序列是指廣泛分布于染色體基因組中具高度多態(tài)性的簡單串聯(lián)重復(fù)序列，在弓形蟲，這種重復(fù)序列一般比較簡單，重復(fù)單位最少是2個核苷酸，重復(fù)次數(shù)為2～20次[12]，正是由于重復(fù)次數(shù)的差異，導致了DNA序列長度的多態(tài)性。一般認為，真核生物中微衛(wèi)星序列的進化速度比較快，在每次復(fù)制中每個位點的突變率為10-2～10-5，而SNPs的突變率為10-9～10-10。通過對弓形蟲3種主要基因型的大量分離株的研究發(fā)現(xiàn)，弓形蟲的微衛(wèi)星序列進化速度較慢[12,15]。雖然對弓形蟲SNPs和微衛(wèi)星序列精確的突變率尚不清楚，但是弓形蟲微衛(wèi)星序列的突變率要比SNPs的高，多態(tài)性要比SNPs好，在遺傳學鑒定方面具有更高的分辨率。對微衛(wèi)星序列的分析是通過PCR擴增和測序的方法完成的，該方法已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于錐蟲[16]、利什曼原蟲[17]、瘧原蟲[18]和隱孢子蟲[19]的分型研究，弓形蟲方面最早的研究是在1997年。到目前為止，至少有13個微衛(wèi)星和1個小衛(wèi)星被用于弓形蟲分離株的基因型分析[12, 15, 20]，它們分布于已知基因的內(nèi)含子內(nèi)(如編碼 β-微管蛋白的TUB2基因)及表達序列標簽內(nèi)等。該方法是所有分型方法中分辨率最高、準確性最好的。當樣品量比較充足、對成本要求不高時，該方法是一個非常好的選擇。為了提高該方法的敏感性，2005年，Ajzenberg等選擇了其中的5個微衛(wèi)星，建立了多重、多位點的微衛(wèi)星分析法[21]。但與多位點Mn-PCR-RFLP分析法相比，由于成本高等方面的問題，該方法的應(yīng)用受到了一定的限制。

4 隨機擴增多態(tài)性DNA

隨機擴增多態(tài)性DNA (Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD)是建立在PCR基礎(chǔ)上的一種可對整個未知序列的基因組進行多態(tài)性分析的技術(shù)，它以單個人工合成的隨機多態(tài)核苷酸序列(通常為10個堿基對)為引物，對基因組DNA進行擴增，通過電泳顯示其片段的多態(tài)性。與常規(guī)PCR相比，RAPD技術(shù)無需設(shè)計特定引物，簡便、快速、成本低、無放射性污染等，并且樣品用量少，可對整個基因組做變異研究，該方法曾被用來區(qū)分弓形蟲鼠毒力型和非毒力型蟲株[22]。但是，RAPD圖譜中某些弱條帶的重復(fù)性較差，并且該方法在引物長度、引物序列、應(yīng)用的引物數(shù)目和擴增反應(yīng)條件等實驗技術(shù)方面還未標準化，影響了不同條件下結(jié)果的可比性等。簡單重復(fù)序列PCR(SSR-PCR)和RAPD相似，用的引物是單微衛(wèi)星序列，重復(fù)性比RAPD好[22]，但由于宿主的DNA有可能會被擴增，這兩種方法均不能對臨床組織樣品中弓形蟲DNA進行擴增。

5 血清型分析法

血清型分析法是合成一些構(gòu)成弓形蟲抗原的肽類，這些肽是由弓形蟲多態(tài)性的位點編碼的，如GRA6和GRA7[23]。僅需通過檢測宿主的血清抗體就可以對弓形蟲的遺傳學進行鑒定。但這種方法的成本比較高，目前尚未用于流行病學研究中。

6 內(nèi)含子測序分析法

內(nèi)含子是一個基因中非編碼DNA片段，分開相鄰的外顯子。大量分子進化方面的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子對研究種內(nèi)遺傳進化方面也具有重要的意義[24]。內(nèi)含子測序分析法是對內(nèi)含子進行擴增測序，檢測內(nèi)含子序列內(nèi)的SNPs。2005年和2006年Khan發(fā)現(xiàn)PCR-RFLP分析法并不能對弓形蟲等位基因之間的多態(tài)性進行非常準確的評估，而弓形蟲的內(nèi)含子很適合進行種內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育的比較。其對來自免疫抑制病人和眼弓形蟲病人的弓形蟲分離株先進行多位點PCR-RFLP分析，發(fā)現(xiàn)其僅是重組基因型，再對其進行內(nèi)含子測序，結(jié)果顯示其出現(xiàn)了不同于古老克隆系的新的多態(tài)性[25-26]。這對進一步分析該蟲株的起源具有很重要的意義。2007年Khan選擇了8個內(nèi)含子對46株弓形蟲進行測序和種系進化分析，將這些蟲株分為11個組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些組之間有非常明顯的地域分布差異[27]。因此，內(nèi)含子分析法在研究弓形蟲的遺傳進化方面具有重要的意義。

Su等于2010年通過試驗也進一步提出了測序內(nèi)含子的重要性和必要性[2]，同時采用Mn-PCR-RFLP分析法和內(nèi)含子分析法為研究弓形蟲的遺傳進化，區(qū)分單克隆系、重組基因型及新基因型提供了非常有力的工具，也為不同實驗室間檢測結(jié)果的比較分析奠定了基礎(chǔ)。目前該方法已被廣泛應(yīng)用。測序的內(nèi)含子包括UPRT-intron 1、UPRT-intron 7、GRA6、GRA7、EF1-intron1和HP-intron2[27-28]。

綜上所述，弓形蟲是一種真核細胞生物，其基因組比較復(fù)雜，而每種分型方法均有其優(yōu)缺點，為能夠準確地把握其遺傳結(jié)構(gòu)，要選擇多個遺傳標記進行綜合分析。在上述方法中，目前被公認的、應(yīng)用最廣泛的是10 Markers Mn-PCR-RFLP方法，利用該方法已將弓形蟲至少分為141個基因型(www.toxodb.org)。為了更全面地進行弓形蟲遺傳進化方面的研究，應(yīng)再結(jié)合內(nèi)含子測序法對其綜合分析。

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