高然 裴雪梅 張文武

鈉通道阻滯劑對(duì)癲癇大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響

高然 裴雪梅 張文武

目的 研究鈉通道阻滯劑對(duì)癲癇大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的影響。方法 以鈉通道阻滯劑拉莫三嗪為干預(yù)因素, 通過(guò)制作大鼠癲癇模型, 對(duì)比正常對(duì)照組、正常給藥組、癲癇模型組和癲癇治療組大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果 癲癇模型組大鼠神經(jīng)元胞核、胞質(zhì)改變明顯, 癲癇治療組神經(jīng)元線粒體腫脹減輕。結(jié)論 鈉通道阻滯劑對(duì)癲癇大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)有影響。

鈉通道阻滯劑;癲癇;拉莫三嗪;超微結(jié)構(gòu)

癲癇(Epilepsy)患者的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化, 大量神經(jīng)元變性、線粒體損傷, 其周圍膠質(zhì)細(xì)胞水腫、突觸增多,這些變化影響癲癇的治療及其預(yù)后。新型鈉離子通道阻滯劑拉莫三嗪因作用效果好、對(duì)神經(jīng)功能損傷小, 已做為全身強(qiáng)直陣攣的一線藥物被臨床廣泛應(yīng)用, 此類藥物研究多集中在電生理及免疫方面［1,2］, 對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)超微結(jié)構(gòu)影響尚未有人報(bào)道。本研究以拉莫三嗪為干預(yù)因素, 通過(guò)制作大鼠癲癇模型, 對(duì)比正常對(duì)照組、正常給藥組、癲癇模型組和癲癇治療組大鼠, 研究該藥是否對(duì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)有影響, 以探討該藥對(duì)癲癇轉(zhuǎn)歸及預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 云南系健康成年雄性SD大鼠40只,體重(350±20)g (深圳寶安區(qū)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供), 隨機(jī)分為4組, 每組各10只：①正常對(duì)照組(A組)：未給予任何干預(yù)措施。②正常給藥組(B組)：正常大鼠予拉莫三嗪灌胃。③癲癇模型組(C組)：以馬桑內(nèi)脂為致癲劑造癲癇模型, 未用拉莫三嗪治療。④癲癇治療組(D組)：以馬桑內(nèi)脂為致癲劑造癲癇模型, 用拉莫三嗪灌胃治療。

1.1. 2 藥品試劑、儀器 拉莫三嗪片(商品名 安閑 湖南三金制藥有限責(zé)任公司);JEM-1400透射電子顯微鏡(JEOL);熱膨脹式超薄切片機(jī)(Leica)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備及取材 每次造模均在上午9∶00～11∶00進(jìn)行。取大鼠稱重后按10 μl/g劑量吸取致癲劑馬桑內(nèi)脂, 微量注射器將馬桑內(nèi)脂注入大鼠腦室內(nèi), 觀察其活動(dòng)以Racine做標(biāo)準(zhǔn)：1級(jí):動(dòng)須、咀嚼;2級(jí)：節(jié)律性點(diǎn)頭;3級(jí)：一側(cè)前肢陣攣;4級(jí)：站立伴雙前肢陣攣;5級(jí)：4級(jí)+跌倒伴全身抽搐。達(dá)到3級(jí)或3級(jí)以上為制備成功標(biāo)準(zhǔn)。四組在相同條件(清潔、通風(fēng)、恒溫、恒濕)下飼養(yǎng)14 d, 正常給藥組、癲癇治療組每天均在同一時(shí)間作灌胃(拉莫三嗪0.15 mg·kg-1·d-1)治療。

1.2.2 固定及取材 作灌注固定, 乙醚麻醉大鼠, 固定四肢,開(kāi)胸找到心包膜剪開(kāi), 穿刺針從心尖部刺入主動(dòng)脈時(shí)用止血鉗夾閉, 先輸生理鹽水并剪開(kāi)右心耳觀察流出液體量和澄清度, 當(dāng)流出液體變澄清, 肝臟變白時(shí), 繼輸4%多聚甲醛, 先快后慢, 見(jiàn)大鼠出現(xiàn)肌抖動(dòng)消失后繼續(xù)灌注30 min。破顱骨后完整的取出腦組織放入4%多聚甲醛中繼續(xù)浸泡固定, 浸泡固定時(shí)間為6 h溫度4℃。

1.2.3 透射電鏡 在進(jìn)行切片之前先將包埋塊修整成所需形狀和大小, 制好切片刀和水槽。用Leica熱膨脹式超薄切片機(jī)切片, 厚度40 nm。將超薄切片放到銅網(wǎng)(已泡二甲苯去脂, 晾干并覆上1% Formar膜)上, 經(jīng)醋酸鈾和枸櫞酸鉛雙染色后電鏡觀察。

2 結(jié)果

JEM-1400透射電鏡在20000倍下觀察：①正常對(duì)照組神經(jīng)元線粒體基質(zhì)均勻, 電子密度一致, 雙層膜和板狀嵴清晰, 可見(jiàn)較多的高爾基復(fù)合體、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 豐富的線粒體、尼氏體及神經(jīng)原纖維。其周圍星形膠質(zhì)細(xì)胞質(zhì)較少, 胞質(zhì)的基質(zhì)較疏松, 著色均勻, 有疏松分布的核糖體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng), 線粒體數(shù)量多, 體積小。神經(jīng)氈內(nèi)有無(wú)髓神經(jīng)纖維, 有髓神經(jīng)纖維和大量的星形膠質(zhì)細(xì)胞突起。②正常給藥組神經(jīng)元與正常對(duì)照組幾乎無(wú)差別。③癲癇模型組神經(jīng)元線粒體腫脹明顯,結(jié)構(gòu)模糊, 嵴變形扭曲、斷裂消失, 伴線粒體內(nèi)、外膜的崩解,且部分線粒體呈空泡變。主要表現(xiàn)為粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體擴(kuò)張, 線粒體腫脹明顯, 髓樣變性, 尼氏體溶解, 核膜斷裂及胞質(zhì)水腫。星形膠質(zhì)細(xì)胞胞體腫脹而增大, 細(xì)胞質(zhì)電子密度明顯低而清亮, 細(xì)胞器未見(jiàn)明顯改變。神經(jīng)氈內(nèi)膠質(zhì)細(xì)胞突起明顯, 因腫脹而增粗, 其終末部分變尖, 細(xì)胞外間隙縮小, 神經(jīng)元的胞突及有髓神經(jīng)纖維和無(wú)髓神經(jīng)纖維改變不明顯。④癲癇治療組神經(jīng)元線粒體腫脹仍較減輕, 嵴破裂,部分線粒體基質(zhì)中出現(xiàn)邊界不清的絮狀物, 細(xì)胞電子密度增高, 星形膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)及突起腫脹較癲癇模型組減輕。

3 討論

電壓門控鈉通道(VGSCs)是內(nèi)在的神經(jīng)元和神經(jīng)肌肉興奮性的關(guān)鍵因子, 阻滯鈉通道減少神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢划a(chǎn)生可用于癲癇治療, 尤其像SCN1A突變癲癇。而像腦外傷、顱內(nèi)感染、腦卒中及腦腫瘤等原因造成癲癇時(shí), 大腦神經(jīng)元結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變線粒體腫脹、細(xì)胞器崩解、胞漿出空白區(qū)、軸突末梢變性等不同程度的損傷, 鈉通道阻滯劑是否有作用？癲癇發(fā)病的形態(tài)基礎(chǔ)如核膜不連續(xù)、大量腫大的線粒體、軸突的發(fā)芽等神經(jīng)壞死凋亡的特征, 這些特征導(dǎo)致神經(jīng)元合成和釋放GABA的功能降低神經(jīng)遞質(zhì)失衡、神經(jīng)元苔蘚狀纖維發(fā)芽(MFS)建立出返回性興奮回路。本研究中用藥后的神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)發(fā)生改變可以與下列因素有關(guān)：①阻滯了Na+內(nèi)流, 通過(guò)鈉鈣轉(zhuǎn)換蛋白使細(xì)胞內(nèi)Ca2+相應(yīng)減少。Ca2+可通過(guò)NMDA受體減少癇樣放電, 同時(shí)通過(guò)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)減輕線粒體水腫, ATP合成增加。②阻滯了Na+內(nèi)流增加膜穩(wěn)定, 除可增加細(xì)胞閾電位水平外還可增加GABA釋放減少癲癇發(fā)作?？赏茢噔c通道阻滯劑除了減少發(fā)病率外還可減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷對(duì)該病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后良性影響。

［1］ Dibue M, Kamp MA, Alpdogan S, et al. Cav 2.3 (R-type) calcium channels are critical for mediating anticonvulsive and neuroprotective properties of lamotrigine in vivo. Epilepsia, 2013, 54(9): 1542-1550.

［2］ Nakatani Y, Masuko H, Amano T. The effect of lamotrigine on Na(v)1.4 voltage-gated sodium channels. J Pharmacol Sci, 2013, 123(2): 203-206.

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