許 浪 (武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430061)

腫瘤組織中存在極少量具有無(wú)限自我更新能力和多向增殖潛能的細(xì)胞，即腫瘤干細(xì)胞(CSC)，它們不僅在腫瘤的形成、發(fā)展和轉(zhuǎn)移方面起著重要的作用，也可能是腫瘤耐藥及抵抗放化療的根源〔1，2〕。Nanog基因作為全能性或多能性干細(xì)胞標(biāo)記物，在胚胎干細(xì)胞和包括肺癌、胃癌在內(nèi)的多種 CSC中表達(dá)〔3，4〕。本研究旨在揭示順鉑干預(yù)人胃癌SGC7901細(xì)胞后，對(duì)胃癌干細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人胃癌細(xì)胞株SGC7901由武漢大學(xué)生命科學(xué)院惠贈(zèng)。小鼠抗人Nanog多克隆抗體(Cell signaling公司)，SP-9000免疫組化試劑盒及DBA顯色試劑盒(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司);胎牛血清(杭州四季青公司);DMEM培養(yǎng)基、胰酶(Gibco公司)，Transwell小室(Corning公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌SGC7901細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基不含抗生素，5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 體外順鉑干預(yù) 將細(xì)胞接種于96孔板，分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組第2天加順鉑，先通過(guò)MTT計(jì)算出加入順鉑作用72 h的IC50(7.22 μg/ml)，接種6孔板，第2天加入順鉑至終濃度5 μg/ml(低于IC50濃度)，72 h后收取細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。無(wú)藥物干預(yù)作為對(duì)照組。

1.4 Hoechst33342染色法 檢測(cè)順鉑對(duì)SGC7901細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例的影響。藥物干預(yù)完成后，倒掉舊的培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3～5次，加入新的培養(yǎng)液，再加入Hoechst33342至終濃度為5 μg/ml，37℃避光孵育90 min，倒掉舊的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液1 ml，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照(隨機(jī)選取5×200倍視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算SP細(xì)胞所占的比例)。重復(fù)6次。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué) 將兩組細(xì)胞分別爬片處理，PBS沖洗，冷丙酮固定10 min。按SP-9000試劑盒步驟檢測(cè)Nanog。用已知陽(yáng)性的精原細(xì)胞切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。隨機(jī)選取5×200倍視野，分別計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占的比例。重復(fù)6次。

1.6 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn) 利用Transwell小室進(jìn)行SGC7901細(xì)胞體外侵襲力的測(cè)定:4℃溶解Matrigel，每孔50 μl加入預(yù)冷的Transwell小室的上室中，胰酶溶解消化細(xì)胞，用含1%牛血清白蛋白的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1×106ml－1，每孔200 μl加入各孔上室。余下按使用說(shuō)明操作，完成后隨機(jī)于100倍光鏡下取上、下、左、右中心5個(gè)視野，計(jì)算穿膜細(xì)胞，取其平均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 順鉑干預(yù)后SGC7901細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例Hoechst33342染色后，熒光顯微鏡下可見(jiàn)SP細(xì)胞的胞核較大，呈圓形或橢圓形，淡然或者低染。與對(duì)照組(2.43%±0.62%)相比，實(shí)驗(yàn)組SP細(xì)胞比例(5.54% ±1.66%)增高(P＜0.05)。

2.2 順鉑干預(yù)后Nanog表達(dá) 對(duì)照組Nanog蛋白主要表達(dá)在胞質(zhì)，染色細(xì)胞少且弱，核內(nèi)少見(jiàn)表達(dá)。而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表達(dá)增多且強(qiáng)，核表達(dá)細(xì)胞數(shù)目增多。實(shí)驗(yàn)組 Nanog蛋白表達(dá)(79.15% ±10.33%)較對(duì)照組(55.23% ±3.67%)明顯增高(P＜0.05)。

2.3 順鉑干預(yù)后SGC7901細(xì)胞侵襲力 實(shí)驗(yàn)組穿膜細(xì)胞數(shù)〔(63±8)個(gè)〕較對(duì)照組〔(42±7)個(gè)〕明顯增多(P＜0.05)。

3 討論

現(xiàn)階段，化療仍然是臨床治療胃癌的主要手段之一。雖然化療的方案各有不同，但大多含有順鉑。目前化療的效果并不理想，一般只能短期控制肺癌的發(fā)展，無(wú)法根治胃癌，而且由于后期往往產(chǎn)生明顯的耐藥性，胃癌細(xì)胞可能出現(xiàn)加速生長(zhǎng)，很快發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移等現(xiàn)象。CSC學(xué)說(shuō)的確立為腫瘤的研究和治療帶來(lái)了新的理念〔5，6〕。CSC在腫瘤的異質(zhì)性中處于“塔尖”的位置，與耐藥性的形成也有著密切的關(guān)系〔7〕。Pan等〔8〕證實(shí)，肺癌CSC比腫瘤內(nèi)其他成熟癌細(xì)胞對(duì)化療更具有抗藥性，導(dǎo)致化療方案無(wú)法徹底治愈肺癌。類似的結(jié)果還在肝癌等腫瘤中得到證實(shí)〔9〕。

Nanog是目前公認(rèn)的CSC標(biāo)志性基因，其表達(dá)與CSC的自我增殖等能力密切相關(guān)。在乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌的研究中都證明〔10〕，Nanog與CSC的關(guān)系密切并影響著這些腫瘤的生物學(xué)行為、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)、治療及預(yù)后，Nanog在CSC中的表達(dá)明顯高于腫瘤內(nèi)其他成熟癌細(xì)胞。腫瘤中Nanog高水平表達(dá)者往往進(jìn)展快、易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后差。

本研究說(shuō)明相比于普通的胃癌細(xì)胞，CSC對(duì)以順鉑為代表的化療藥物有更強(qiáng)的耐受性。CSC的存在與腫瘤化療的耐藥性有著密切的關(guān)系。推測(cè)順鉑只能有效殺死普通胃癌細(xì)胞，而對(duì)CSC沒(méi)有明顯殺傷作用。因此，用藥后CSC反而以更快的速度生長(zhǎng)，表現(xiàn)為比例的增加，表現(xiàn)出明顯的惡性腫瘤生物學(xué)特性，提示其參與了耐藥性的發(fā)生。但胃癌耐藥性的發(fā)生是否完全歸咎于CSC，需要進(jìn)一步研究。

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