顧美超，盧天罡，劉云海，倪和民，張劭俁，翟椿東，邢書涵，郭勇

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

研究報(bào)告

凍融后小鼠休眠胚胎超微結(jié)構(gòu)的變化

顧美超，盧天罡，劉云海，倪和民，張劭俁，翟椿東，邢書涵，郭勇

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,北京 102206)

目的從亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的角度揭示其抗凍能力優(yōu)于正常孵化胚胎的原因。方法利用透射電子顯微鏡觀察小鼠休眠胚胎與正常孵化期胚胎在細(xì)胞連接和各細(xì)胞器形態(tài)與分布上的差異,以及凍融培養(yǎng)后的變化,并進(jìn)行相關(guān)比較分析。結(jié)果通過亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)比分析發(fā)現(xiàn):冷凍前小鼠休眠胚胎為緊縮狀,處于能量代謝較低的“基態(tài)”,通過凍融后培養(yǎng),細(xì)胞器結(jié)構(gòu)恢復(fù)與正常孵化胚胎冷凍前相似;而正常孵化胚胎經(jīng)過凍融后,線粒體數(shù)量減少,細(xì)胞核松散,異染色質(zhì)增多。結(jié)論小鼠休眠胚胎與正常孵化胚胎凍融后相比,其細(xì)胞狀態(tài)更有利于物質(zhì)儲(chǔ)存及能量代謝,表明小鼠休眠胚胎從亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的角度比其正常孵化胚胎更具抗凍性。

小鼠;休眠胚胎;超微結(jié)構(gòu);凍融

動(dòng)物的胚胎休眠又稱為胚胎滯育或胚胎的不連續(xù)發(fā)育,在哺乳動(dòng)物上稱為延遲植入,它是一種進(jìn)化方式,以此來保證野生動(dòng)物在極端環(huán)境條件下的繁殖成功率。一旦休眠終止,囊胚恢復(fù)新陳代謝活性,細(xì)胞又開始增殖,囊胚著床并繼續(xù)發(fā)育。胚胎滯育現(xiàn)象可以最大限度的提高哺乳動(dòng)物繁殖成功率,并盡量使后代在氣候適宜且食物充足時(shí)出生［1］。因此針對(duì)哺乳動(dòng)物的休眠胚胎進(jìn)行較廣泛的相關(guān)生物學(xué)研究具有一定的理論意義和潛在應(yīng)用價(jià)值［2,3］。雖然目前國(guó)際上對(duì)小鼠等哺乳動(dòng)物休眠胚胎的相關(guān)研究取得了巨大進(jìn)展,但針對(duì)此類特殊胚胎進(jìn)行冷凍及解凍復(fù)蘇后形態(tài)及其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)上的研究尚未見報(bào)道。2008年,盧天罡等［4］首次發(fā)現(xiàn):小鼠休眠胚胎冷凍-解凍后經(jīng)體外培養(yǎng)的復(fù)蘇率顯著高于正常孵化胚胎。有鑒于此,本研究對(duì)小鼠休眠胚胎經(jīng)程序化冷凍-解凍后與正常孵化胚胎進(jìn)行亞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)上的差異進(jìn)行比較,為進(jìn)一步深入研究哺乳動(dòng)物休眠胚胎凍融后細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化及抗凍劑研制,尤其是為動(dòng)物低溫生物學(xué)方面的研究提供新的參考途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)ICR雌、雄小鼠各40只,8～12周齡,體重為26～28 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司【SCXK(京)2012-0001】。實(shí)驗(yàn)在北京農(nóng)學(xué)院屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(京)2010-0003】。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與器材

胚胎冷凍保護(hù)劑,購(gòu)自ICPbio Reproduction,貨號(hào):101129,新西蘭;戊二醛,購(gòu)自Sigma,貨號(hào):CAS: 111-30-8;丙酮,購(gòu)自Sigma,貨號(hào):CAS:67-64-1;鋨酸,購(gòu)自Sigma,CAS:20816-12-0,均為美國(guó);普通光學(xué)顯微鏡:Nikon,YS2-H,日本;胚胎冷凍儀:Cryobath;超薄切片機(jī)Leica Uc6i,德國(guó);透射電鏡JEM-1230,日本。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超排處理

選擇陰門淡粉色的雌性鼠,腹腔注射PMSG 10 IU/只,48 h后注射hCG 10 IU/只,之后立即與成年雄鼠1∶1合籠過夜交配,次日早8點(diǎn)檢查交配情況,見陰道栓者即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 休眠胚胎的獲取

于見栓的第4天上午9:00摘除小鼠的雙側(cè)卵巢,之后連續(xù)3d在其頸部皮下注射0.2 mg/mL的孕酮0.1 mL,術(shù)后第4天即可從其子宮中回收休眠胚胎。

1.3.3 胚胎的程序化冷凍、冷凍后胚胎的收集及解凍方法

將獲得胚胎用PBS清洗兩遍,以確保囊胚表面清潔無粘連細(xì)胞。然后用三步法脫去PBS至冷凍液中,濃度依次變化,清洗兩遍,然后裝管。把裝好的麥管放入冷凍儀中,以1℃/min的速度降到-5℃之后,平衡10 min。再用預(yù)冷的鑷子在麥管上端進(jìn)行植冰,之后以0.3℃/min的速度降到-35℃。解凍時(shí)需把麥管取出于室溫下輕輕晃動(dòng)8～10 s,并立即投入到35℃左右的溫水中。剪掉麥管兩端的栓部,將麥管里的胚胎置于含有1.0 mol/L蔗糖溶液的培養(yǎng)皿中,按三步法脫去冷凍液。詳見文獻(xiàn)［4］。

1.3.4 小鼠胚胎固定、包埋和超薄切片的制備

前固定:將胚胎移至培養(yǎng)皿中,加入0.5%甲醛工作液及3%戊二醛混合一起加到培養(yǎng)皿中固定1 h后,用0.1 mol/L磷酸緩沖液做成100μL小滴反復(fù)清洗3次,每次5 min。后固定:用1%鋨酸繼續(xù)固定1 h后,再用0.1mol/L磷酸緩沖液做成小滴反復(fù)清洗2次,每次5 min,清洗干凈。預(yù)包埋:該實(shí)驗(yàn)采用的3%～4%瓊脂進(jìn)行預(yù)包埋,等待瓊脂固化之后,將含有小鼠囊胚的瓊脂切成1 mm3的小塊,分別放到青霉素瓶中。切片觀察:分別經(jīng)一系列酒精脫水、環(huán)氧丙烷過渡等脫水處理小鼠囊胚,之后環(huán)氧樹脂Epon812浸透、包埋、聚合和LKB-型超薄切片機(jī)切片。最后,醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛的染料進(jìn)行染色,干燥后,透過透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 正常孵化期胚胎

2.1.1 滋養(yǎng)層細(xì)胞連接

通過電鏡觀察小鼠正常囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)周圍的滋養(yǎng)層細(xì)胞的形狀呈圓形或者近似的正立方體型,且形狀均一。并且在滋養(yǎng)層細(xì)胞之間有分布均勻的緊密連接結(jié)構(gòu)。偶爾指狀結(jié)構(gòu)可見在其中,但是并無相嵌的并指狀結(jié)構(gòu)。

2.1.2 細(xì)胞核

小鼠正常囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞,細(xì)胞核及內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞核形態(tài)大致相似,大部分為圓形,邊緣較平緩,但有很小的起伏和凹凸。細(xì)胞核被兩層核膜包裹,可見一個(gè)或者兩個(gè)高密度的核仁,整個(gè)細(xì)胞核布滿常染色質(zhì),異染色質(zhì)的分布較少,一般聚集于核膜周圍(見圖1A,彩插9)。

2.1.3 細(xì)胞器

電鏡下可見大量圓形或橢圓形的線粒體分布在正常囊胚的胞質(zhì)及滋養(yǎng)層核內(nèi)細(xì)胞團(tuán)胞質(zhì)中。同時(shí)在成熟的線粒體中,可見線粒體嵴密集且清晰。豐富的核糖體顆粒分布在胞質(zhì)中。發(fā)現(xiàn)有粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與線粒體相互連接的結(jié)構(gòu)。呈弓形或半球形的高爾基體堆積在一起。大量的脂滴及空泡分布在正常孵化期囊胚的滋養(yǎng)層細(xì)胞中。并且脂滴大小不一,在0.5～2μm之間(見圖1B)(圖1見彩插9)。

2.2 休眠胚胎

2.2.1 滋養(yǎng)層細(xì)胞連接

休眠囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞和覆蓋在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)上的滋養(yǎng)層細(xì)胞在形態(tài)上都被拉長(zhǎng),呈長(zhǎng)條狀。指狀結(jié)構(gòu)變的鈍圓連接在細(xì)胞間,并有像微絨毛樣的手指樣結(jié)構(gòu)伸向臨近的細(xì)胞,這種手指樣結(jié)構(gòu)相互嵌合起來形成并指樣結(jié)構(gòu),與緊密連接黏合斑和橋粒共同組成休眠胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的細(xì)胞連接。

2.2.2 細(xì)胞核

休眠胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞核邊緣不平整,有較多凹陷,且凹陷較深。大量的異染色團(tuán)塊分布在核膜周圍,顏色較深,容易辨認(rèn)。細(xì)胞核核仁明顯,未發(fā)現(xiàn)有兩個(gè)或兩個(gè)以上核仁的情況(見圖2B,圖2見彩插10)。

2.2.3 細(xì)胞器

在休眠胚胎中可見有直徑達(dá)到6μm的大型脂滴(見圖2A)。內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞和滋養(yǎng)層細(xì)胞質(zhì)中核糖體數(shù)量較少,偶然可以發(fā)現(xiàn)核糖體聚集成多聚核糖體(見圖2C)。(圖2見彩插10)。

2.3 正常孵化胚胎凍融后培養(yǎng)24 h后

2.3.1 滋養(yǎng)層細(xì)胞連接

正常孵化期胚胎與冷凍前相比,其滋養(yǎng)層細(xì)胞形態(tài)變化不大,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞間結(jié)構(gòu)較冷凍前松散,細(xì)胞間連接有較大的縫隙(見圖2C)。凍融后滋養(yǎng)層細(xì)胞的胞質(zhì)中有大量的空泡。有些細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中幾乎是空泡。滋養(yǎng)層細(xì)胞之間連接可見到模糊的緊密連接結(jié)構(gòu),與冷凍前相比變化不大。細(xì)胞表面的微絨毛變長(zhǎng),數(shù)量增加,但仍呈不規(guī)則形態(tài)。經(jīng)過48 h的體外培養(yǎng),滋養(yǎng)層細(xì)胞連接方式與培養(yǎng)前無變化。

2.3.2 細(xì)胞核

電鏡下正常胚胎細(xì)胞核與冷凍前相比,其核形態(tài)排列不規(guī)整,尤其是內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞核,有多道較深的凹陷出現(xiàn)。48h后孵化胚胎細(xì)胞開始出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象(見圖1E)。

2.3.3 細(xì)胞器

凍融培養(yǎng)后的正常孵化期胚胎,發(fā)現(xiàn)線粒體雖然數(shù)量較冷凍前無明顯變化,但大部分線粒體嵴不清晰,數(shù)量較少,有的線粒體嵴消失,觀察中發(fā)現(xiàn)有部分線粒體中存在空泡和高密度物質(zhì),部分線粒體膜發(fā)生破損且內(nèi)容物流出。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上附著核糖體顆粒,細(xì)胞質(zhì)中核糖體分布不均勻,有的區(qū)域有很多核糖體分布,而有的則較少或者沒有,可發(fā)現(xiàn)多核糖體(見圖2D)。

2.4 休眠胚胎凍融后培養(yǎng)24 h后

2.4.1 滋養(yǎng)層細(xì)胞連接

休眠胚胎經(jīng)過凍融培養(yǎng)后滋養(yǎng)層細(xì)胞變厚,由冷凍前的長(zhǎng)條狀變成立方體狀或近似的圓形,且只有在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)周圍的滋養(yǎng)層細(xì)胞仍然呈長(zhǎng)條狀。冷凍后滋養(yǎng)層細(xì)胞間的并指狀結(jié)構(gòu)消失(見圖2D),指狀結(jié)構(gòu)收縮在連接部位且不再伸展,可見到緊密連接斑。細(xì)胞間連接較冷凍前緊密,內(nèi)細(xì)胞團(tuán)連接緊密,無較大縫隙。經(jīng)過48 h培養(yǎng)后,與凍融培養(yǎng)24 h后結(jié)果相似。

2.4.2 細(xì)胞核

休眠胚胎與冷凍前相比,其細(xì)胞凹陷消失,凹凸較平緩,核周隙不明顯。培養(yǎng)48 h之后,細(xì)胞核邊緣的較深凹陷消失,變的平坦。

2.4.3 細(xì)胞器

休眠胚胎與冷凍前相比,細(xì)胞內(nèi)線粒體數(shù)目顯著增加,線粒體比較清晰。偶發(fā)現(xiàn)空泡狀線粒體的存在。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量與冷凍前相比明顯增加。高爾基體數(shù)量較冷凍前也有增加。細(xì)胞質(zhì)中核糖體分布廣泛,多核糖體廣泛分布。脂滴的數(shù)量和體積較冷凍前都明顯減少(見圖2E)。培養(yǎng)48 h后,大型脂滴消失且數(shù)量減少。

3 討論

胚胎休眠現(xiàn)象廣泛存在于各種動(dòng)物,但現(xiàn)在已知最好的動(dòng)物模型是嚙齒類動(dòng)物,嚙齒類動(dòng)物的子宮環(huán)境可在孕激素和生長(zhǎng)因子的協(xié)同作用下維持胚胎一直處于休眠狀態(tài)［5］。早先Spindler等［6］對(duì)正常孵化胚胎與休眠胚胎在碳氧化物方面進(jìn)行比較。發(fā)現(xiàn)休眠囊胚代謝較低。Give等［7］檢測(cè)了小鼠見栓第4天卵巢摘除后不同時(shí)間胚胎細(xì)胞的DNA合成,發(fā)現(xiàn)在卵巢摘除手術(shù)18h后胚胎細(xì)胞DNA合成仍然保持高水平,隨后在96 h后下降,并在隨后一直保持低水平。在2000年,Renfree等［1］發(fā)現(xiàn)休眠胚胎是母體子宮源和胚胎源的信號(hào)因子共同調(diào)控的結(jié)果。同時(shí)在哺乳動(dòng)物植入時(shí)窗口期信號(hào)白細(xì)胞抑制因子等信號(hào)之間的相互調(diào)節(jié)［8,9］。在我實(shí)驗(yàn)室早期對(duì)小鼠正常孵化及休眠囊胚在抗凍方面的比較,休眠囊胚的抗凍性顯著高于休眠囊胚,由此推斷休眠囊胚的特殊亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)可能對(duì)于其抗凍能力有影響。

在該試驗(yàn)中,休眠胚胎與正常孵化胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的連接形式有很大不同,雖然兩種胚胎中都存在手指狀結(jié)構(gòu),但是休眠胚胎中的相嵌樣的并指狀結(jié)構(gòu),及與緊密連接斑一起構(gòu)成牢固的細(xì)胞間連接。正常孵化胚胎的指狀結(jié)構(gòu)并不是突出地伸向相臨細(xì)胞,而是平順的貼在細(xì)胞外側(cè),沒有相嵌狀結(jié)構(gòu)。我們又發(fā)現(xiàn)不經(jīng)過凍融,只在體外培養(yǎng)24 h后休眠胚胎的超微結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞間的并指狀細(xì)胞連接消失。依據(jù)這些證據(jù),我們提出一個(gè)假設(shè),那就是休眠胚胎經(jīng)過凍融或培養(yǎng)后被激活了,考慮這種細(xì)胞間堅(jiān)固的連接結(jié)構(gòu)是前期冷凍試驗(yàn)中休眠囊胚抗凍能力較孵化胚囊好的一個(gè)必不可少的原因。休眠囊胚由于在結(jié)實(shí)而緊密的細(xì)胞連接及其碳氧化物的代謝率較低,細(xì)胞釋放能量很少。每個(gè)細(xì)胞形成一種維持自己較低的最佳“穩(wěn)態(tài)”。由此對(duì)外界各種刺激作用抵抗能力比在釋放能量高的孵化胚胎強(qiáng)。

在動(dòng)物界中,肉食動(dòng)物的卵母細(xì)胞、胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞中都會(huì)含有大量且豐富的脂滴［10］。Enders等［11］發(fā)現(xiàn)大小不一的脂滴是水貂在自然環(huán)境下維持延遲著床時(shí)胚胎能量代謝的典型中間物質(zhì)。Allen等［12］在西部斑點(diǎn)臭鼬的休眠胚胎上也發(fā)現(xiàn)大量體積較大的脂滴,這些脂滴呈深色或黑色。本研究發(fā)現(xiàn),休眠胚胎和正常活化胚胎上都可見到大小不等的脂滴,直徑一般都在1～2 mm之間,而休眠胚胎上體積達(dá)到6 mm的大型脂滴,這可能是由于休眠胚胎自身代謝水平較低,脂類消耗較慢,使得脂類物質(zhì)堆積而成。這也說明休眠胚胎的脂類物質(zhì)儲(chǔ)備要多于孵化胚胎(見圖2A)。在休眠胚胎解凍復(fù)蘇后48 h后,休眠胚胎中的大型脂滴消失,脂滴的數(shù)量減少。由此脂類在小鼠休眠胚胎上也是一種物質(zhì)儲(chǔ)備,經(jīng)過冷凍復(fù)蘇后的胚胎開始活化,動(dòng)員每個(gè)細(xì)胞中可利用的能量物質(zhì),使得囊胚的新陳代謝增加。脂類消耗增加。脂滴的數(shù)量減少。有文獻(xiàn)記載,小鼠休眠胚胎與激活胚胎的差異比較中,激活囊胚通過注射一定量的雌二醇使正在處于休眠狀態(tài)的胚胎進(jìn)行了激活［13］。我們可能懷疑在休眠囊胚凍融后的狀態(tài)與其后期注射雌激素使其狀態(tài)激活的效果相似,但此想法還未被證實(shí)。

研究中發(fā)現(xiàn),休眠胚胎細(xì)胞核邊緣不平整,有較多凹陷,分布在核膜周圍。而孵化胚胎細(xì)胞核邊緣較平滑,沒有凹陷。這和Allen等［12］研究結(jié)果相類似,他們發(fā)現(xiàn)在西部斑點(diǎn)臭鼬的休眠胚胎細(xì)胞核有兩至三個(gè)裂縫,并且含有高密度的異染色質(zhì)。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)在小鼠植入前胚胎上普遍游離核糖體增加的過程［14,15］。Wu等［16］發(fā)現(xiàn)被雌激素刺激誘導(dǎo)激活的休眠胚胎普遍有游離核糖體數(shù)量的增加現(xiàn)象。在凍融試驗(yàn)中,休眠胚胎細(xì)胞核的恢復(fù)能力明顯比孵化胚胎強(qiáng)。這表明休眠胚胎在冷凍后其狀態(tài)優(yōu)于正常孵化胚胎。但在凍融后的分子機(jī)制調(diào)節(jié)仍不清楚。經(jīng)過凍融,培養(yǎng)后休眠胚胎胞質(zhì)中核糖體數(shù)量有明顯增加。線粒體提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量的80%以上的能量,而嵴的存在大大增加了線粒體內(nèi)膜的表面積和相應(yīng)的反應(yīng)效率［18］。經(jīng)過解凍復(fù)蘇,休眠胚胎及正常孵化胚胎都發(fā)現(xiàn)了嵴普遍消失和橫斷,以及膜破損,空泡和高密度物質(zhì)形成的現(xiàn)象。但是休眠胚胎的線粒體嵴多為橫斷,橫斷后嵴呈顆粒狀。有文獻(xiàn)記載在病理狀況下,線粒體的數(shù)目減少［18］。由此可以說明,休眠胚胎在這個(gè)階段線粒體供給能量的功能要優(yōu)于孵化胚胎,雖然凍融對(duì)于兩種胚胎的線粒體都有所損傷,但是休眠胚胎的線粒體要比正常孵化胚胎受到的損傷小,或者是在凍融后培養(yǎng)過程中,恢復(fù)能力較好。

綜上所述,通過凍融后亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析小鼠的休眠胚胎與正常孵化胚胎,在冷凍前休眠胚胎為皺縮狀,處于能量代謝較低的“基態(tài)”,通過凍融后培養(yǎng),細(xì)胞代謝增加。而正常孵化胚胎冷凍后,線粒體數(shù)量減少,細(xì)胞核結(jié)構(gòu)松散。這些結(jié)果表明,休眠胚胎可能通過冷凍復(fù)蘇或體外培養(yǎng)的形式等被激活了,不排除可能是培養(yǎng)液中血清物質(zhì)或者其他添加物質(zhì)的刺激,這個(gè)推論還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。但可以肯定的是,休眠胚胎的特殊結(jié)構(gòu)和代謝基態(tài),使其處于抵抗外界損傷較佳狀態(tài)。

(本文圖1，2見彩插9，10)。

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Ultrastructural observation of dormantmouse embryos cultured in vitro after freezing-thaw ing

GU Mei-chao,LU Tian-gang,LIU Yun-hai,NIHe-min,ZHANG Shao-yu, ZHAIChun-dong,XING Shu-han,GUO Yong*
(College of Animal Science and Technology,Beijing University of Agriculture,Beijing 102206,China)

ObjectiveThe aim of this study was to investigate the differences of the cell ultrastucture of normal mouse hatched blastocysts and their dormant ones cultured in vitro after freezing-thawing,and to explore whether the dormant embryos have a better anti-freezing shock property than the normal hatchedmouse embryos.M ethodsBy transmission electronmicroscopy,the ultrastructure of these two types ofmouse embryoswas observed and analyzed.ResultsBy comparative analysis of their ultrastructure,the results showed that the dormant embryos before freezing are being austerity and with lower energymetabolism at a‘ground state’.After freezing-thawing and culture,their cellular structure seemed to be similar to that of the normal embryos cultured in vitro before freezing.However,after freezing-thawing and culture,the number ofmitochondria decreased,the nucleiwere loose,and their heterochromatin also increased.ConclusionsFrom the ultrastructural observation,compared with the normalmouse hatched embryos,the cellular state of dormantmouse embryos after freezing-thawing ismore favorable formaterial storage and energymetabolism,thus,indicating that they have a better anti-freezing property than normal hatched embryos.

Mouse;Dormant embryo;Ultrastructure;Freezing-thawing

Q95-33,Q492

A

1005-4847(2014)03-0053-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2014.03.011

2014-03-19

國(guó)家自然基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):31272526);2013年度北京市教委北京市屬高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)與教師職業(yè)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào):PXM2013_014207_000067)。

顧美超(1988年-),女,碩士生。E-mail:gumeichao@163.com。

郭勇,男,教授。E-mail:y63guo@126.com。