肖菲菲，黃恩炯，張建明，關(guān) 雄

蚊蟲不僅刺叮騷擾，而且是登革熱、黃熱病、淋巴絲蟲病、西方馬腦炎、西尼羅熱、瘧疾等多種蟲媒傳染病的傳播媒介。蚊蟲具有兼吸人、鳥、獸等多種宿主血液的習(xí)性，這種嗜血習(xí)性使原本儲(chǔ)存在動(dòng)物宿主中的病原體通過(guò)蚊蟲的“橋梁媒介”傳播到人群中。復(fù)雜的嗜血習(xí)性正是非自育性蚊蟲成為多種疾病傳播媒介或潛在傳播媒介的根本原因。

近年來(lái)，基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，并且對(duì)揭示細(xì)胞生理活動(dòng)規(guī)律發(fā)揮了重要作用，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是最早發(fā)展起來(lái)且應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括 mRNA和非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA）［1］。研究血餐前后轉(zhuǎn)錄組的變化，不僅可以明確蚊蟲吸血前后的分子差異，量化轉(zhuǎn)錄本在血餐前后表達(dá)水平的變化，還可以基因功能和結(jié)構(gòu)為出發(fā)點(diǎn)，揭示基因表達(dá)與特定代謝途徑間的內(nèi)在聯(lián)系，從而為尋找防治蚊蟲的新靶標(biāo)，開辟新的蚊蟲治理途徑提供理論依據(jù)。

1 血餐引起的代謝變化

吸血前，雌蚊一般靠吸食糖水來(lái)維持生命力。據(jù)報(bào)道，吸食糖水的雌蚊中有28個(gè)特異表達(dá)基因，產(chǎn)物以基礎(chǔ)代謝為主，如肽酶、蛋白酶等。吸血后，雌蚊會(huì)經(jīng)歷一系列生理變化，飽血作為一個(gè)信號(hào)，會(huì)刺激雌蚊中腸蛋白質(zhì)的水解活性，有近80%的蛋白質(zhì)在一天內(nèi)會(huì)被消化［2－5］。這些基因表達(dá)的變化反映了蚊蟲從吸食糖水到吸血過(guò)程中轉(zhuǎn)錄水平的轉(zhuǎn)變。從糖代謝到蛋白質(zhì)代謝，蚊蟲需要一定的過(guò)渡時(shí)間，岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）血餐后在紅細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)一定數(shù)量的糖蛋白，血餐后6h編碼糖蛋白的基因上調(diào)，在血餐后12～24h才緩緩下調(diào)，說(shuō)明血餐后一段時(shí)間還在對(duì)糖類進(jìn)行代謝。不同吸血時(shí)間和吸血后不同時(shí)段的岡比亞按蚊轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表明，在血餐后開始的幾個(gè)小時(shí)氧化磷酸化、碳水化合物代謝、蛋白質(zhì)代謝、核酸代謝轉(zhuǎn)運(yùn)活躍，其中有11個(gè)基因參與蛋白質(zhì)消化（包含5個(gè)水解蛋白基因、2個(gè)胰蛋白酶、1個(gè)糜蛋白酶、1個(gè)絲氨酸蛋白酶、1個(gè)羧肽酶）［6］。埃及伊蚊（Aedes aegypti）在血餐后上調(diào)的基因產(chǎn)物富集量大于50倍的轉(zhuǎn)錄本有21個(gè)，其中15個(gè)與消化酶有關(guān)。岡比亞按蚊血餐后有40個(gè)特異的差異表達(dá)基因，包括中腸的2個(gè)絲氨酸蛋白酶和胰蛋白酶（Trypsin），trypsin1和trypsin2均是在血餐后被誘導(dǎo)出來(lái)的。實(shí)驗(yàn)證明，trypsin2mRNA 在蚊蟲血餐后8，12，24h富集［7－8］。與trypsin1，2不同，trypsin3，4，7在未吸血雌蚊中就表達(dá)，trpsin4在血餐48h后接近生殖營(yíng)養(yǎng)末期才大量富集。有假說(shuō)認(rèn)為trpsin3，4，7的表達(dá)在某種程度上誘導(dǎo)了trpsin1和2的表達(dá)。在蚊蟲中腸可以檢測(cè)到糜蛋白酶1，2，其在血餐12h后表達(dá)，并在48h富集量大增，這與trpsin3-7類似［9］。磷脂酶被認(rèn)為在血液消化中起一定作用，埃及伊蚊在血餐15h后中腸的解脂活性開始增強(qiáng)，但其功能還未被證實(shí)［10］。

2 血餐引起的卵巢發(fā)育

卵巢周期分為4個(gè)階段：1）卵黃生成前期，2）啟動(dòng)期，3）營(yíng)養(yǎng)期，4）營(yíng)養(yǎng)后期［11］。對(duì)于非自育性蚊類來(lái)講，雌蚊在血餐后48h會(huì)將20%的營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化為卵子成熟所需成分。事實(shí)上，雌蚊一羽化，卵子生成就隨之啟動(dòng)，血餐時(shí)卵母細(xì)胞的發(fā)育會(huì)暫時(shí)滯緩，直到重啟階段卵巢會(huì)繼續(xù)發(fā)育直到卵莢成熟被排出。成功的產(chǎn)卵過(guò)程不僅需要一系列卵巢發(fā)育過(guò)程和卵子成熟，還需要卵黃的合成。將岡比亞按蚊血餐后不同時(shí)期的差異表達(dá)基因分為前期基因（early gene）、中期基因 （middle gene）和后期基因（late gene），中期基因在血餐后前3h下調(diào)，血餐后5h緩慢上調(diào)，在12～24h內(nèi)有高峰，而后下調(diào)至血餐后48h；后期基因在血餐后12～16h表現(xiàn)出持續(xù)緩慢下調(diào)，與中期基因不同的是其在48h富集量大增。有趣的是，中期基因和后期基因的表達(dá)曲線分別與蛻皮激素和保幼激素的分泌曲線類似，與卵巢發(fā)育和卵黃生成相關(guān)的基因正是屬于中期和后期基因。電鏡下觀察致倦庫(kù)蚊（Culex quinquefasiatus）血餐后不同時(shí)間點(diǎn)的卵巢切片，血餐后12h才可見蛋黃素顆粒，直至72h逐漸降解［12］，進(jìn)一步證實(shí)卵黃生成相關(guān)的基因表達(dá)模式屬于中后期基因。正是隨著保幼激素和蛻皮激素的分泌，雌蟲體內(nèi)的代謝隨之發(fā)生了變化，從而促進(jìn)卵巢發(fā)育和卵黃的成熟。在岡比亞按蚊中編碼激酶錨定蛋白的基因在血餐后5 h才上調(diào)，在12～24h富集量最大，該基因在卵子生成中通過(guò)調(diào)節(jié)激酶C蛋白的活性調(diào)控卵子生成過(guò)程。但還存在一些功能尚不明確的基因，如岡比亞按蚊的AS453基因，該基因在血餐后48h才大量表達(dá)，有調(diào)節(jié)卵子生成的作用，但是具體功能尚不得而知。

3 血餐誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)

吸血是蚊蟲攜帶的病原體在脊椎動(dòng)物間傳播的最主要途徑。血液作為雌蚊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)來(lái)源的同時(shí)，也會(huì)對(duì)雌蚊產(chǎn)生影響，病原體在雌蚊體內(nèi)會(huì)和機(jī)體環(huán)境維持一定的平衡關(guān)系。埃及伊蚊存在兩個(gè)不同的內(nèi)在免疫防御機(jī)制：一是利用基因表達(dá)調(diào)控及通過(guò)小RNA調(diào)控途徑的（Small RNA regulatory pathways，SRRPs）mRNA 降解，二是通過(guò) Toll、Imd和JAK-STAT信號(hào)途徑誘導(dǎo)產(chǎn)生抗菌多肽或促進(jìn)吞噬作用、包漿和黑化作用［13］。已有文獻(xiàn)報(bào)道了血液中含有的不同病原體侵染埃及伊蚊后上述通路中基因活性的變化［14－20］。在侵染的數(shù)分鐘內(nèi)，雌蚊體內(nèi)免疫基因便會(huì)開始轉(zhuǎn)錄，但是這些反應(yīng)缺乏免疫記憶。血餐后，在病毒粒體和蚊蟲中腸上皮細(xì)胞接觸的5～7min內(nèi)，病毒就會(huì)被內(nèi)化，從而開始轉(zhuǎn)錄，在感染后2d，病毒便開始自我復(fù)制增殖［21］。有學(xué)者認(rèn)為在雌蚊體內(nèi)存在天然的細(xì)菌群落，并且維持一定水平的免疫應(yīng)答，免疫過(guò)程與消化過(guò)程共享一些生物產(chǎn)物。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，共有477個(gè)轉(zhuǎn)錄本是防御機(jī)制中的候選基因或假定的候選基因，167個(gè)在血餐前后差異表達(dá)，其中88個(gè)下調(diào)，79個(gè)上調(diào)。一些基因編碼接收器和免疫聯(lián)級(jí)效應(yīng)器（清除劑受體、Clip－絲氨酸蛋白酶、肽聚糖識(shí)別蛋白、纖維蛋白原相關(guān)蛋白、C-凝集素、1，3-β-d葡聚糖結(jié)合蛋白和抗菌多肽）［22］，這些基因在血餐后表達(dá)量超過(guò)2倍地下調(diào)。上調(diào)的基因包括sRRP成員的MD-2類似蛋白，MD-2蛋白是一種分泌蛋白，包含了脂類識(shí)別域，在免疫反應(yīng)中起到重要作用。G12蛋白被認(rèn)為在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能。在岡比亞按蚊飽食瘧原蟲感染的血液1h后，中腸內(nèi)腔或在表面的微絨毛上可以檢測(cè)到G12蛋白，在血餐12h后其表達(dá)量達(dá)到最大。將感染西尼羅病毒的血液喂食致倦庫(kù)蚊，也發(fā)現(xiàn)蚊蟲在血餐后G12A2的表達(dá)量增加［23］。

自噬是一種利用溶酶體對(duì)自身結(jié)構(gòu)吞噬降解的過(guò)程，是細(xì)胞內(nèi)的再循環(huán)系統(tǒng)，在維持體內(nèi)平衡、細(xì)胞發(fā)育、成長(zhǎng)、免疫中扮演重要角色，是一種高度調(diào)節(jié)、異化的過(guò)程。涉及到自噬、SRRP通路和細(xì)胞凋亡的轉(zhuǎn)錄本在血餐后也大量富集。埃及伊蚊雌蚊血餐后5h，自噬作用的基因表達(dá)量大增，最大富集量可達(dá)3.10倍，富集基因還包括17個(gè)SRRP成員，Dicer1，Dicer2基因，TSN和PiWi14，這些基因轉(zhuǎn)錄本在血餐后以2倍富集。Dicer2和TSN基因是RNA干擾效應(yīng)器和誘導(dǎo)RNA完全沉默的共同組成成分，Dicer1調(diào)控管家基因的表達(dá)，PIW14是PIWI小RNA途徑的成員，與抗病毒防御機(jī)制有關(guān)［24］。但相比參與消化代謝的轉(zhuǎn)錄本來(lái)說(shuō)，與免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本累積水平較低，大多以2倍量富集，這個(gè)發(fā)現(xiàn)證實(shí)了蚊蟲在吸血后免疫階段會(huì)出現(xiàn)一個(gè)間隔期的假說(shuō)。血餐后免疫基因表達(dá)量的低下有利于病原體侵染宿主蚊蟲，如登革熱病毒在數(shù)分鐘內(nèi)便可以侵染埃及伊蚊中腸上皮細(xì)胞。

4 血餐調(diào)控的嗅覺基因

蚊蟲通過(guò)嗅覺系統(tǒng)感受宿主呼吸以及粘液和皮膚汗液等散發(fā)的氣味來(lái)尋找定位宿主，其中氣味結(jié)合蛋白（odorant-binding protein，OBP）和氣味受體（odorant receptor，OR）作用最關(guān)鍵，它們參與了蚊蟲對(duì)宿主氣味分子的識(shí)別過(guò)程。分析吸血和和只吸食糖水的埃及伊蚊轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)有5個(gè)氣味結(jié)合蛋白基因只在吸食糖水的雌蚊中特異性表達(dá)，這些基因可能只在尋找糖水來(lái)源才發(fā)揮作用，但其是否在尋找非血源食料中發(fā)揮作用尚不清楚。對(duì)埃及伊蚊不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)氣味結(jié)合蛋白相關(guān)的基因只在成蟲期表達(dá)，這證實(shí)了搜尋宿主等行為只發(fā)生在成蟲［25］。血餐前，嗅覺基因表達(dá)量增加，用于尋找定位宿主，吸血后，蚊蟲體內(nèi)消化等其他代謝途徑增強(qiáng)，在這一生殖營(yíng)養(yǎng)周期中完成尋找宿主和吸血后，嗅覺基因的表達(dá)量便下調(diào)。

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