崔天盆 鄭承紅 陳 杰 蘇斌濤(武漢市第一醫(yī)院臨床免疫學實驗室，武漢 430022)

細胞死亡可根據(jù)其表觀形態(tài)學分為:細胞凋亡、壞死、細胞自噬等;也可根據(jù)有無核酸酶或不同類別的蛋白酶的參與分為:半胱天冬酶參與的細胞死亡，鈣激活中性蛋白酶參與的細胞死亡，組織蛋白酶和谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶參與的細胞死亡;還可以根據(jù)功能方面分為:程序性的細胞死亡，意外的細胞死亡，生理性的細胞死亡或病理性的細胞死亡;或者根據(jù)免疫學特性分為:免疫原性的細胞死亡或無免疫原性的細胞死亡。2009年細胞死亡命名委員會(Nomenclature Committee on Cell Death，NCCD)［1］建議統(tǒng)一根據(jù)形態(tài)學標準定義和分類細胞死亡，目前發(fā)現(xiàn)細胞死亡種類有凋亡(Apoptosis)、自噬性細胞死亡(Autophagic cell death)、壞死(Necrosis)、角化性細胞死亡(Cornification)、非典型細胞死亡，包括有絲分裂崩潰(Mitotic catastrophe)、失巢凋亡(Anoikis)、沃勒變性(Wallerian degeneration)、副凋亡(Paraptosis)、細胞焦亡(Pyroptosis)、內(nèi) 亡(Entosis)、興奮性中毒(Excitotoxicity)、鐵死亡(Ferroptosis)。死亡細胞的有效清除對一個有機體的存活是必要的。正在死亡的或者已經(jīng)死亡細胞的通過吞噬作用清除，根據(jù)不同的細胞死亡模式即凋亡、自噬和壞死，存在不同的機制來保證細胞殘骸的清除。

1 細胞死亡種類

1.1 凋亡 細胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主、有序的死亡方式。凋亡細胞膜發(fā)生皺縮、凹陷，染色質(zhì)固縮，最后核碎片，很少或根本沒有細胞器超微結構改變，細胞膜將細胞質(zhì)分割包圍，有些包圍了染色質(zhì)片段，形成多個膜結構尚完整的泡狀小體，稱為凋亡小體。由于介紹文獻很多，本文不再累述。

1.2 自噬和自噬性細胞死亡 1962年Ashford和Porter在實驗中發(fā)現(xiàn)自食(self-eating)現(xiàn)象［2］，比利時細胞學家和生物化學家、1974年諾貝爾生理學和醫(yī)學獎獲得者 De Duve在1963年提出自噬(Autophagy)的概念［3］。自噬發(fā)生在生理狀態(tài)下，參與細胞的基本生理過程，但是也可由不同應激所引發(fā)，自噬活性可成倍增加。自噬在細胞重塑、清除受損的或多余的細胞器、維持細胞動態(tài)平衡等過程中扮演重要角色，但是細胞利用自噬機制降解外來和自身物質(zhì)的識別機制還不清楚。自噬按其發(fā)生的方式不同，可以分為大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)和分子伴侶介導的自噬(Chaperonee-mediated autophagy)。

自噬是細胞內(nèi)物質(zhì)利用溶酶體被降解的總稱，它是真核細胞所特有的。細胞內(nèi)的物質(zhì)主要有兩種降解途徑，一種通過蛋白酶體被降解，另一種通過自噬作用。蛋白酶體主要降解胞內(nèi)短壽命蛋白，而自噬負責長壽命蛋白和一些細胞器的降解。雖然毫無疑問，自噬促進細胞存活，在多種生理情況和實驗中觀察到死亡誘導刺激撤出后“自噬性細胞死亡”仍然可以恢復細胞活性。自噬性細胞死亡的定義:細胞死亡過程中不發(fā)生染色質(zhì)凝集，但伴隨著胞內(nèi)出現(xiàn)大量自噬空泡(Autophagic vaculization，AV)。與凋亡的細胞不同，在體內(nèi)發(fā)生的自噬性細胞死亡很少或沒有吞噬細胞參與清除。

1.3 壞死 壞死(Necrosis)定義為細胞死亡過程中伴隨細胞體積增大(Oncosis)，細胞器腫脹，質(zhì)膜破裂，細胞內(nèi)成分丟失。很長一段時間，壞死一直被認為是一種不可控的非程序性細胞死亡機制，但是現(xiàn)在認為部分類型的細胞壞死是可以被信號傳導通路所控制。例如，死亡域受體(如 TNFR1、Fas/CD95和TRAIL-R)和Toll樣受體(例如TLR3和TLR4)已被證明引起壞死，特別是在半胱天冬酶抑制劑的存在的條件下，這些分子介導的細胞死亡依賴于RIP1激酶。

程序性細胞壞死機制研究得不是很清楚，如下細胞器和小分子與細胞壞死過程相關。線粒體改變:解偶聯(lián)、產(chǎn)生活性氧、一氧化氮和線粒體膜通透性改變;溶酶體的變化:ROS、溶酶體膜通透性改變;細胞核變化:過度活躍PARP-1和隨之而來的水解的NAD+;脂質(zhì)降解:激活后磷脂酶、脂氧合酶和鞘磷脂;增加胞漿鈣離子(Ca2++)的濃度，導致線粒體過載和激活鈣激活中性蛋白酶、組織蛋白酶［4］。

1.4 角化性細胞死亡 組織學上角化(Cornification)是鱗狀表皮組織形成表皮屏障的過程。在細胞水平，角化性細胞死亡(Cornification)是發(fā)生在表皮程序性細胞死亡的一個非常具體的形式，形態(tài)和生化特征與凋亡明顯不同。角化伴隨角蛋白L、兜甲蛋白(Loricrin)、富脯氨酸蛋白(Small proline-rich proteins)和外皮蛋白(involucrin)和脂類——例如脂肪酸和ω-羥基神經(jīng)酰胺，這些是皮膚角化層的功能的產(chǎn)生。角化過程中，類似于其他脫核的組織——晶狀體上皮細胞和成熟紅細胞，細胞核和細胞器消失，在終末階段，細胞代謝停滯，細胞完全被角蛋白和較大的角蛋白中間纖維充斥。與角質(zhì)細胞不同，無論是成熟紅細胞和還是晶狀體上皮細胞在一定條件下不導致細胞死亡，角化被視為一個真正的細胞死亡程序。在分子水平上，角化是上皮細胞分化在外部環(huán)境和內(nèi)部酶和底物相互作用下形成的。通過交聯(lián)的酶如鈣依賴性轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶-1、3、5(Transglutaminase)作用于多個底物(例如兜甲蛋白，富脯氨酸蛋白，套膜蛋白和SP100)，以及通過特殊脂類的合成并被釋放到細胞外基質(zhì)和蛋白酶［1，5］。

1.5 非典型細胞死亡方式

1.5.1 有絲分裂崩潰 細胞周期是由一系列連續(xù)事件按精確的時間順序進行的動態(tài)過程，受到DNA損傷檢查點和紡錘體組裝檢查點等細胞周期檢查點的精密調(diào)控。當DNA受到損傷或紡錘體結構破壞，細胞會通過一系列的信號通路激活細胞周期檢查點，使細胞周期停滯，對DNA損傷進行修復，如果損傷太大無法修復，細胞便啟動死亡通路，導致細胞有絲分裂崩潰(Mitotic catastrophe)［1，6］。

有絲分裂崩潰是一種細胞死亡模式，在有絲分裂期間或之后不久發(fā)生的有絲分裂異常狀態(tài)，可伴有形態(tài)學改變，包括微核和多核(胞質(zhì)分裂缺陷導致存在兩個或兩個以上相似或異構的核)。然而并沒有將這一廣泛使用的術語達成共識，有絲分裂崩潰可導致細胞凋亡、壞死和衰老。細胞有絲分裂崩潰是由多種分子調(diào)控的過程，其死亡信號傳遞有很大一部分與凋亡相重疊。在發(fā)生機制上，PI3K/AKT、CDK1、P53及生存素等參與有絲分裂崩潰的調(diào)控。

1.5.2 失巢凋亡 失巢凋亡(Anoikis)，一種特殊的細胞程序性死亡，是由于細胞與細胞外基質(zhì)或相鄰細胞脫離接觸而誘發(fā)的。失巢凋亡作為一種特殊的程序化細胞死亡形式，在機體發(fā)育、組織自身平衡、疾病發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移中起重要作用。由于歷史文獻庫相當量的文獻使用失巢凋亡一詞，NCDD建議保留。失巢凋亡通過傳統(tǒng)的細胞凋亡途徑誘導細胞死亡。整合蛋白感知和傳導細胞外基質(zhì)信號而控制細胞的黏附和存活，Bcl-2和某些Bcl-2相關蛋白廣泛參與細胞失巢凋亡的調(diào)節(jié)，多種蛋白激酶信號分子參與失巢凋亡的信號轉(zhuǎn)導［7］。

1.5.3 沃勒變性 沃勒變性(Wallerian degeneration)是發(fā)生在神經(jīng)系統(tǒng)中的一種少見形式的細胞自食，其特征主要在于細胞的分解代謝，如，一個神經(jīng)元軸突發(fā)生部分退化，但并不影響神經(jīng)元胞體。沃勒變性并不是嚴格意義上的細胞死亡，因為沃勒變性神經(jīng)元仍然未死，只是軸突變性死亡［8］。

1.5.4 副凋亡(Paraptosis) 副凋亡(Paraptosis)這個術語最初是用來描述形態(tài)和PCD的一種形式，是Ⅲ型程序性細胞死亡中的典型代表。副凋亡典型特征是由線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹造成的胞漿空泡化。與壞死不同的是，副凋亡并不出現(xiàn)細胞膜的破壞。副凋亡由胰島素樣生長因子受體1的表達所激發(fā)，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹造成的胞漿空泡化，但是沒有凋亡的其他形態(tài)特征。半胱天冬酶抑制劑和過表達抗凋亡蛋白BCL2-XL不能抑制副凋亡，副凋亡TUNEL陰性。可能是絲裂原活化蛋白激酶的成員介導副凋亡發(fā)生。副凋亡與凋亡也有一些共同點，如細胞膜表面磷脂酰絲氨酸外翻、線粒體跨膜電位下降［1，4］。

1.5.5 細胞焦亡 首先在感染沙門氏菌巨噬細胞時發(fā)現(xiàn)細胞焦亡(Pyroptosis)，它涉及半胱天冬酶-1而不是半胱天冬酶-3的活化，半胱天冬酶-1被稱為白細胞介素-1β(IL-1β)的轉(zhuǎn)化酶。傷寒沙門氏菌(和其他病原體，如綠膿桿菌和志賀氏菌福氏志賀菌)通過IPAF——一種Apaf-1相關NLR蛋白，誘導胱天蛋白酶-1的活化;炭疽芽孢桿菌致死毒素通過Nalp1誘發(fā)IPAF，不需要Apaf-1。此外，脂多糖處理的巨噬細胞經(jīng)過細胞焦亡的接頭蛋白介導的ASC，ASC與胱天蛋白酶-1一起形成超分子的細胞質(zhì)復合體——細胞焦亡體(Pyroptosome)。因此，不同的途徑誘導胱天蛋白酶-1活化導致細胞焦亡。這種細胞死亡形式導致釋放的IL-1β(這是一個主要發(fā)熱誘導細胞因子或熱原)和IL-18可能會起到相應的局部和全身炎癥反應。巨噬細胞焦亡無細胞凋亡形態(tài)特征，但是顯示了一些壞死相關性狀［9］。

1.5.6 內(nèi)亡 內(nèi)亡(Entosis)或叫侵入性細胞死亡最初描述亨廷頓氏病患者細胞自相殘殺的一種形式，是一個新的細胞死亡方式，其中一個細胞吞噬另一個活細胞，被吞噬細胞最后死于吞噬小體。在侵入性死亡過程中，細胞通過鈣黏著蛋白介導的細胞間連接作用，經(jīng)內(nèi)化過程侵入臨近的宿主細胞空泡內(nèi)，被溶胞體酶系降解而導致死亡。細胞侵入性死亡可能在抑制腫瘤細胞的增殖中發(fā)揮作用，并已在乳腺癌細胞中得到初步證實。細胞侵入性死亡最有效的細胞模型是MCF-7乳腺癌細胞，MCF-7既無半胱天冬酶-1也無Beclin-1，因此是凋亡和自噬無能細胞。細胞侵入性死亡既不被 BCL-2也不被ZVAD-fmk所抑制，內(nèi)吞細胞最初是活的，隨后被溶胞體酶系降解而導致死亡［10］。

1.5.7 興奮性中毒 興奮性中毒(Excitotoxicity)是神經(jīng)元死亡的一種形式，神經(jīng)元受到興奮性氨基酸如谷氨酸的刺激，導致N-甲基-D-天門冬氨酸鈣離子滲透通道的開放，導致胞內(nèi)鈣超載和死亡信號激活，興奮性中毒的信號與細胞凋亡和壞死信號重疊，MMP的參與是其關鍵點，一氧化氮參與信號轉(zhuǎn)導。興奮性中毒不能被認為是作為一個單獨的細胞死亡方式［11］。

1.5.8 鐵死亡 2012年，Dixon等［12］提出了一種叫做鐵死亡(Ferroptosis)的鐵依賴性的細胞死亡形式，該死亡方式受細胞內(nèi)信號通路的嚴密調(diào)節(jié)，鐵死亡典型的特征為線粒體變小，但雙層膜的密度增加，同時表現(xiàn)為細胞質(zhì)以及脂質(zhì)活性氧自由基增多。用erastin孵育N-RAS基因突變的人纖維肉瘤細胞系HT-1080細胞，研究發(fā)現(xiàn)，細胞的ROS和死亡率增加，同時加入去鐵胺共孵育降低了細胞ROS聚集和細胞死亡。鐵死亡與RAS腫瘤細胞的死亡和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生有密切關系。

2 細胞死亡的清除

凋亡和壞死通過不同的機制來保證細胞殘骸的清除，如不能有效清除，就會導致組織結構紊亂，血管栓塞，引起炎癥和自身免疫反應。臨床上系統(tǒng)性紅斑狼瘡、慢性阻塞性肺疾病、動脈粥樣硬化等均存在凋亡和壞死細胞清除障礙。由于死亡細胞的清除研究剛剛起步，研究較多的是凋亡和壞死細胞的清除，故此文重點介紹這兩方面。

2.1 凋亡細胞的清除 過去十五年凋亡的分子機制的闡明較充分，但是凋亡細胞碎片的清除機制研究較少。凋亡的細胞或者凋亡小體最初是被完整的質(zhì)膜包裹的，如果它們不能在短的時間內(nèi)被清除，它們將繼發(fā)壞死，釋放有免疫原性的細胞內(nèi)成分到細胞外。在實體器官，死亡的細胞在大多數(shù)情況下由鄰近的細胞吞噬清除。

眾所周知，在凋亡的過程中新的分子會出現(xiàn)在細胞的表面。最熟知的就是磷脂酰絲氨酸(PS)從細胞膜的內(nèi)表面進入外表面。PS對巨噬細胞識別和吞噬的重要性首先發(fā)現(xiàn)于紅細胞，衰老的紅細胞清除跟凋亡細胞類似，依賴Fas-半胱天冬酶-3/半胱天冬酶-8信號導致的PS外翻;還有N-乙酰葡萄糖胺和巖藻糖的表達增加。這些變化累積成一個對吞噬細胞來說代表強烈的“吃我”信號的凋亡特異性的表面模式。吞噬細胞必須被凋亡細胞分泌的所謂的“找我”信號像溶血磷脂(LPC)所趨化。在炎癥過程中釋放的潛在的“找我”信號或者介質(zhì)，是膜聯(lián)蛋白Ⅰ和/或者脂氧素。

吞噬就是攝入大小超過0.5 μm顆粒。在這個過程中，巨噬細胞通過細胞骨架重排包圍即將被消化的顆粒，形成一個所謂的吞噬環(huán)。環(huán)繞顆粒完成后，顆粒就被包埋在質(zhì)膜小囊中，形成了吞噬小體，隨后它成熟為吞噬溶酶體。

大多數(shù)關于凋亡細胞被巨噬細胞吞噬后的免疫學結局是沒有炎癥反應或者一個已經(jīng)存在的促炎反應在吞噬發(fā)生后被下調(diào)。巨噬細胞消化凋亡細胞后的抗炎效應的發(fā)揮主要是分泌及上調(diào)TGF-β，血小板活化因子，IL-10和前列腺素E2。許多研究揭示未成熟的樹突狀細胞(iDCs)在消化凋亡的細胞后并不能成熟為向T細胞提呈自身抗原的抗原提呈細胞［13，14］。

2.2 壞死細胞和細胞碎片的清除 原發(fā)性的或者繼發(fā)性的壞死細胞的最終去處:(1)調(diào)理壞死細胞及其細胞碎片像凋亡細胞樣被清除;(2)壞死的細胞碎片被細胞外的蛋白水解酶和核酶水解消化，隨后降解的大分子被重吸收。已經(jīng)證實的是壞死的細胞也能通過吞噬移除。與凋亡細胞不同，壞死細胞經(jīng)歷了胞膜的破壞被裂解后導致細胞成分擴散進入細胞外間隙，這樣使巨噬細胞很難收集碎片。與凋亡的細胞相比，壞死的細胞的吞噬不是那么有效，而且發(fā)生較晚。壞死細胞吞噬的機制被認為是巨胞飲作用，胞膜完整與否不重要。巨噬細胞形成廣泛的膜皺褶最后形成一個長的細的突起，后者蜿蜒包裹壞死的碎片，促使壞死細胞碎片與細胞外液體一起在巨胞飲體中被消化。而凋亡細胞被消化是通過吞噬過程中拉鏈樣的機制，這個過程的發(fā)生需要一個未受損的質(zhì)膜的存在［13-15］。

壞死細胞被吞噬后的免疫結果與凋亡細胞不同，壞死細胞的攝入僅能增強但是不能有效誘導巨噬細胞的活化。壞死裂解的中性粒細胞誘導促炎反應，通過釋放巨噬細胞炎癥蛋白2(Macrophageinflammatory protein-2)。在壞死中性粒細胞細胞攝取過程中，從壞死中性粒細胞釋放的絲氨酸蛋白酶彈性蛋白酶作為一個促炎危險信號。高遷移率族蛋白1(HMGB1)被認為作為一個危險信號，它的炎癥效應不僅是由于作為趨化因子的作用，也是由于它誘導促炎細胞因子的能力。熱休克蛋白Hsp72是另一個危險信號因子，與LPS單獨作用相比，Hsp72與LPS協(xié)同刺激巨噬細胞產(chǎn)生一個更強的細胞因子反應。幾個比較壞死細胞與凋亡細胞被iDCs吞噬的研究揭示:與凋亡細胞不同，原發(fā)性和繼發(fā)性壞死細胞的消化導致iDCs的成熟，表達遷移到次級淋巴器官所需的趨化因子受體，有效地將抗原提呈到CD4+和CD8+的T細胞。

2.3 與壞死細胞清除有關的細胞外機制 壞死細胞碎片清除的第二個主要方式是細胞外酶促進清除，隨后巨分子被吞噬細胞重吸收。促進水解的酶包括出現(xiàn)在循環(huán)和細胞外液中核酶和水解酶系統(tǒng)(凝血和纖溶系統(tǒng))，或者由募集來的活化的吞噬細胞分泌的酶。此外，通過細胞自身釋放的溶酶體酶自溶可能在某些情況下也起作用。

體外實驗證實與凋亡細胞相比，壞死細胞的清除發(fā)生較晚，因為膜破裂后，細胞內(nèi)成分是自由流動的，巨噬細胞很難收集壞死細胞碎片。血漿內(nèi)源性核酶DNA酶Ⅰ和纖溶酶原系統(tǒng)成分能穿透壞死細胞，在細胞和核結構的纖溶酶原被纖溶酶原活化因子活化后，纖溶酶原被轉(zhuǎn)化活化的絲氨酸蛋白酶-纖溶酶。纖溶酶降解染色質(zhì)的結構性蛋白如組蛋白，促進DNA酶Ⅰ降解染色質(zhì)。C1q可以結合DNA，也能穿透壞死細胞，去結合核成分。C1q能促進染色質(zhì)被血清DNA酶Ⅰ的降解。還有，C1q可調(diào)理壞死細胞來源的核和染色質(zhì)被巨噬細胞攝?。?6］。

最后，一個好的細胞死亡命名法只有當它能預測藥理學或者基因調(diào)節(jié)的細胞死亡，或者能預測活體內(nèi)的細胞死亡，這種細胞死亡命名法才被認為是有用的，因此目前的形態(tài)學命名法有一定局限性［1］。死亡細胞的有效清除對一個有機體的存活是必要的。正在死亡的或者已經(jīng)死亡細胞通過吞噬作用清除，隨后通過水解酶完成細胞內(nèi)的降解，根據(jù)細胞死亡模式:凋亡、自噬和壞死，存在不同的機制來保證細胞殘骸的清除。在PCD的過程中，小的易消化的細胞殘骸可以被迅速和有效的吞噬，由于壞死細胞的細胞膜完整性的缺乏和細胞膜破裂后細胞內(nèi)容物的播散，壞死細胞碎片的清除經(jīng)常被推遲。細胞外的機制(水解酶、細胞巨分子的調(diào)理吞噬)是經(jīng)典的細胞吞噬作用的補充。其他非典型死亡清除研究較少，有待今后的進一步研究。

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