許建華 趙 輝 賀 薪

(江蘇省睢寧縣林牧漁業(yè)局，江蘇徐州 221200)

血凝和血凝抑制試驗(yàn)是獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測雞新城疫、禽流感免疫后抗體的常用方法之一。它也是檢查防疫質(zhì)量的重要依據(jù)。但在實(shí)驗(yàn)操作中，經(jīng)常受到各種因素的影響，帶來試驗(yàn)結(jié)果誤差。

1 被檢樣品

1.1 采樣

(1)隨機(jī)采集的被檢樣本要能夠代表整個雞群。一般條件下，同一批次的抽檢比例為1%～5%，養(yǎng)殖數(shù)量少于1 000只的，最少采集30個樣本檢測，采樣數(shù)量過少，檢測的結(jié)果不能代表雞群的整體情況。日齡不同、免疫時間不同的樣品，應(yīng)該分開編號，不能混編。

(2)采樣后要及時送檢，不能及時送檢的應(yīng)按照要求進(jìn)行預(yù)處理，分離的血清不能存放時間過久，否則會降低抗體效價。

1.2 被檢血清

采完血樣后，應(yīng)將采血器向后回抽2～3 ml，留出空隙傾斜30°～45°角放置，讓其自然析出血清(夏天放在室內(nèi)，冬天可以放置在37℃溫室內(nèi)析出)。如果采血后馬上離心，由于血液中蛋白，含量不同，含量偏高的血清不易分離，有的易形成膠凍狀或不完全膠凍樣，這樣的血清抗體含量不均勻，檢測的結(jié)果偏差大。分離好的血清若在1周內(nèi)即可檢驗(yàn)，可放在4 ℃冰箱內(nèi)保存；如果短時間內(nèi)不能檢測，應(yīng)放在-20℃～-80℃冰箱內(nèi)保存，運(yùn)送血清時應(yīng)將血清放在盛有冰塊的保溫設(shè)備中運(yùn)送。被檢血清應(yīng)避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融的血清抗體效價會降低。血清保存不當(dāng)，腐敗變質(zhì)會嚴(yán)重影響試驗(yàn)結(jié)果。

2 反應(yīng)板

(1)反應(yīng)板應(yīng)選擇一次性使用96孔V型板，要保持板面及凹孔的干凈，板面應(yīng)水平，不能彎曲、傾斜，使用不合格的反應(yīng)板會嚴(yán)重影響結(jié)果。板孔傾斜的角度會影響紅細(xì)胞的沉降速度，角度過小，紅細(xì)胞沉降加快，血凝價偏低，血凝抑制價偏高。角度過大，紅細(xì)胞沉降減慢，血凝價偏高，血凝抑制價偏低。重復(fù)使用的微量反應(yīng)板應(yīng)保持干凈，其清潔度對試驗(yàn)結(jié)果有很大的影響。當(dāng)反應(yīng)板中殘留紅血球時，測定的血凝效價偏低，血凝抑制效價偏高。反應(yīng)板使用后應(yīng)立即置水龍頭下沖凈血球(壓力大的水龍頭最好)，再用含有洗滌劑的溫水溶液浸泡30 min，并在洗滌劑溶液中以棉拭子刷洗凹孔及板面，再用清水將洗滌液沖洗干凈，放到濃度為2%～3%的鹽酸溶液中浸泡24 h以上，取出用清水沖洗多次，最后，以蒸餾水沖洗2～3次，在37 ℃溫箱中烘干備用。使用前檢查血凝板，將其正對日光燈，孔底光潔透明無可見沉淀附著物為準(zhǔn)。

(2)在試驗(yàn)靜置過程中不能振動反應(yīng)板。當(dāng)反應(yīng)時間沒到而頻繁的取放、觀察反應(yīng)板，操作不甚，凝集會受到影響，測定的凝集價偏低，而凝集抑制價會偏高。因此，在靜置過程中一定要輕拿輕放，最好是等到時間再看結(jié)果，才能保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

3 抗原效價的測定及配制

3.1 抗原的保存

雞新城疫血凝及血凝抑制試驗(yàn)用的抗原一般有液體和干粉兩種，應(yīng)—20 ℃保存。在進(jìn)行抗原效價的測定時，同一種抗原最好兩瓶以上混合后使用，并做重復(fù)試驗(yàn)，取其平均值，減少誤差?？乖哪瘍r在外界不穩(wěn)定，冷藏保存或反復(fù)凍融時其血凝價降低。測定好血凝價的抗原如果一次不能用完時應(yīng)分裝到滅菌離心管內(nèi)，管上標(biāo)注分裝日期和效價，每管的分裝量最好是一次使用量，避免反復(fù)凍融。使用反復(fù)凍融的抗原，血凝抑制滴度會偏高，一般血凝價相差的滴度與血凝抑制價相差的滴度相一致。

3.2 稀釋液

稀釋液應(yīng)使用PH為7.0～7.2的PBS緩沖液，PBS液的pH在5.8以下，紅細(xì)胞易自凝；試驗(yàn)結(jié)果不成立；pH7.8以上凝集的紅細(xì)胞洗脫加快，使得凝集價檢測偏低，凝集抑制價偏高。PBS液要現(xiàn)配現(xiàn)用，如果用生理鹽水代替PBS液，要使用新開瓶的滅菌生理鹽水，稀釋液的配制時間不易過長，否則，可能被環(huán)境污染，不能保持無菌的反應(yīng)環(huán)境，使得檢測結(jié)果受到干擾，出現(xiàn)試驗(yàn)不成立、跳孔等現(xiàn)象。

4 加樣

病毒懸液和紅細(xì)胞懸液在使用前一定要搖勻，以保證每一孔中加入的濃度準(zhǔn)確一致，避免加入的濃度高低不一，人為造成誤差。搖晃紅細(xì)胞懸液時力度不宜過大，防止紅細(xì)胞的結(jié)構(gòu)被破壞，造成溶血。

加液體時，避免吸頭與反應(yīng)板孔接觸造成污染。尤其是在最后加入紅細(xì)胞懸液時，孔內(nèi)已有稀釋液、血清、單位抗原等，如果吸頭接觸到孔內(nèi)混合液，會造成各個孔內(nèi)液體相互污染，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)誤差。所以，在使用移液器時，一定要保持加樣器吸頭與凝集板孔間的距離，以保證每個凝集孔內(nèi)液體數(shù)量和濃度準(zhǔn)確。

稀釋血清時，在吸取第一孔時要先按下移液器，再插入反應(yīng)板孔內(nèi)，吸取后插入第二孔液面以下，在反復(fù)抽取過程中，移液器吸頭不要離開液面，防止產(chǎn)生氣泡，造成移液體積不準(zhǔn)確。

5 溫度和時間

溫度通常應(yīng)在20℃～25℃，不能過高或過低，室溫不適宜的應(yīng)置于恒溫箱內(nèi)。溫度高于37 ℃時，凝集的紅細(xì)胞易洗脫，紅細(xì)胞很快沉降下來，導(dǎo)致試驗(yàn)不成立，低于20 ℃反應(yīng)速度減慢，在規(guī)定時間觀察，對照結(jié)果不成立，此時讀孔，血凝價易判高，血凝抑制價易判低。加入紅細(xì)胞靜置時間應(yīng)按照操作規(guī)程規(guī)定的時間及時觀察，超時10 min以上，紅細(xì)胞發(fā)生裂解，結(jié)果不再有意義。

綜上所述，在血凝和血凝抑制試驗(yàn)中，影響試驗(yàn)結(jié)果的因素很多，只有嚴(yán)格按規(guī)定操作，細(xì)致、耐心地做好每一個環(huán)節(jié)，發(fā)現(xiàn)問題及時糾正處理，才能保證試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確。