李澤鴻，付玉和，劉 瑩，史 飛，劉玉華

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春130118;2.哈爾濱工程大學醫(yī)院，哈爾濱150021)

白喉毒素(DT)是白喉桿菌產(chǎn)生的細菌外毒素，是一個由535個氨基酸組成的多肽，分子量約為62 kDa［1］。有三個不同功能區(qū):N端為催化區(qū)，中間為穿膜區(qū)，C端為受體結合區(qū)，其中催化區(qū)為毒素發(fā)生毒性作用的部位，是白喉毒素的酶活性區(qū)，它通過阻止延長因子-2在核糖體內(nèi)促進多肽鏈延長而抑制蛋白質(zhì)合成造成細胞死亡，具有極強的細胞毒性。這類毒素的毒性很強，能損害哺乳動物的大多數(shù)器官，如心臟、肝臟、肺和腎臟［2］。人類、猴、家兔、豚鼠以及家禽等的組織細胞對白喉毒素均敏感，而小白鼠、大鼠的組織細胞對毒素不敏感。鑒于其對細胞的巨大殺傷作用，近年來白喉毒素被廣泛用于腫瘤的基因治療以及疾病動物模型的建立，白喉毒素就被用在小鼠和人類的抗癌上，而且將它的突變體用于免疫和抗炎，如CRM197雖然沒有白喉毒素的活性，但它含有免疫作用［3］。

免疫毒素(immunotoxins，ITs)的概念源于1906年德國藥物化學家Erhlich提出的靶向治療，免疫毒素是由腫瘤特異性的基團(如抗體生長因子或者是肽)與修飾的毒素組成的嵌合蛋白，這些分子與細胞表面受體結合，然后通過內(nèi)吞作用進入細胞內(nèi)導致細胞死亡。蛋白質(zhì)工程和噬菌體展示技術的進步使得更高親和性的靶向部位的選擇成為可能［4］。因此，在構建免疫毒素時，既要尋找具有細胞選擇性的定向“載體”，又要篩選高效的毒素“彈頭”。近年來也有研究表明不與腫瘤特異性基團結合的重組白喉毒素也對腫瘤細胞具有殺滅作用［5］。由于白喉毒素類免疫毒素能高效、特異地殺傷特定靶細胞，從而使其在腫瘤等疾病的藥物開發(fā)中暫露頭角，1999年美國FDA批準一種基于白喉毒素的免疫毒素ONTAK上市，用于治療成人皮膚細胞淋巴瘤，因而推動了一批白喉毒素類免疫毒素的開發(fā)與臨床研究［5］。隨后的研究表明其在其他一些腫瘤以及一些自身免疫病、免疫排斥方面等也有作用［6］。

1 重組免疫蛋白或者免疫偶聯(lián)物的構建

選擇性免疫毒素的原則在于腫瘤細胞通常具有極少或特定的生長因子，受體或抗原在細胞表面高度表達，與這些分子一致的配體與修飾毒素結合(通過修飾來減少它本來的功能)［7］，近幾年使用被截斷的缺乏受體結合域的白喉毒素來構建重組免疫毒素是獲得有效毒素的最佳方案之一，這種單鏈構造物具有低分子量，更容易轉移進入組織，低毒性等一系列優(yōu)點［8］。

1.1 短肽與白喉毒素的重組構建 基于肽的治療已經(jīng)成為在癌癥靶向治療的最有前途的治療策略之一，抗體基礎上的免疫偶聯(lián)物是以能傳遞細胞毒素到達靶點的單克隆抗體為靶向目標。利用PCR技術構建短肽與白喉毒素的重組原核表達載體，并進行重組蛋白的表達及鑒定，從而為進一步研究導向肽對惡性腫瘤的靶向性治療奠定了基礎［9］。如DT390-triTMTP1能通過選擇性地誘導細胞凋亡和抑制癌細胞增殖來控制癌癥的病情［10］。細胞毒素劑可以是強效藥物、放射性同位素、毒素等，這些分子稱為抗體藥物，偶聯(lián)在白喉毒素基礎上構建的免疫毒素與抗體結合構建免疫偶聯(lián)物是癌癥治療的一種可能的途徑［11］，如白喉毒素和豬細胞毒T淋巴細胞相關抗原4(CD152)構建的重組融合蛋白，通過構建可溶的N-端糖基化和N-端非糖基化的豬CTLA-4經(jīng)過小鼠病理實驗選擇出最具親和力的免疫蛋白用于移植耐受、自身免疫病和癌癥治療［12］。以及二價的抗人的CD3免疫毒素重組體的分子修飾導致小鼠體內(nèi)毒副反應減少［13］，雙特異的配合基定向毒素(DT2219ARL)靶向作用于人類CD19和CD22感受器導致系統(tǒng)B細胞腫瘤的治療功效提高［14］。

1.2 與細胞因子重組的功效 與細胞因子的重組構建相匹配，機體的各種細胞均能合成和分泌小分子的多肽類因子，它們調(diào)節(jié)機體的生理功能，參與各種細胞的增殖、分化、凋亡并行使功能，這些因子稱為細胞因子。根據(jù)細胞因子的功能可將其分為干擾素(IFN)集落刺激因子(CSF)、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子、DT轉化生長因子β(TGF2β)及生長因子等6類［15］，繼ONTAK 之后各國科學家對白喉毒素與細胞因子的重組蛋白進行了很多的研究，如DTIL3K116W(白喉毒素與白介素3的融合蛋白)已進行了一期臨床研究［16］，以白喉毒素為基礎與豬白細胞介素2重組融合蛋白來減少豬的CD25+細胞的研究已證明了其穩(wěn)定性［17］，靶向作用于白血病細胞系的白細胞介素2受體的經(jīng)過修飾的IL2融合毒素蛋白的構建，以及在ONTAK基礎上構建的4個融合蛋白SPRSV1、SPRSV2、SPRSV3、SPRSV4，然后通過各種細胞系實驗檢驗其對白血病細胞系的毒性大小得出最佳選擇［18］，發(fā)現(xiàn)DT388-粒細胞集落刺激生物因子融合蛋白用于骨髓白血?。?9］，DAB389IL-2抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫炎癥同時抑制T細胞介導的神經(jīng)膠質(zhì)靶向細胞［20］，重組細胞免疫毒素蛋白DT390-IP-10在體內(nèi)控制質(zhì)粒DNA編碼弱化實驗性自身免疫［21］等。

2 免疫毒素的純化和篩選

2.1 白喉毒素的毒性 白喉毒素本身毒性過大，不能直接作為抗原使用，研究發(fā)現(xiàn)通過聚合物甲氧基聚乙二醇激活利用共軛親和層析純化DT和DT解毒的替代方法，從純化的毒素所獲得的類毒素維持其免疫原性的特點［22］。很多重組的治療蛋白已經(jīng)通過大腸桿菌被純化，因為大腸桿菌中的表達容易獲得，同時一些不利因素，如蛋白質(zhì)聚集，形成內(nèi)涵體，蛋白被脂多糖污染等均可以適當解決［23］。

2.2 白喉毒素的重組活性區(qū)域 用多重蛋白酶缺陷株BH460可表達出一個N端254個氨基酸炭疽致死因子和N端389個氨基酸的白喉毒素DT389和人類細胞轉變生長因子α(TGFa)的融合蛋白，這個融合蛋白能夠結構性表達，并成功在培養(yǎng)的炭疽桿菌上清液中成功分泌，通過離子交換層析和溶蛋白酶裂解從目標融合蛋白(DT389-TGFa)中除去 LFn［24］。

2.3 重組蛋白的純化 為了獲得有較高生物活性的靶向重組毒素DT389-IL13，在大腸桿菌中高效表達DT389-IL13，并采用凝膠過濾的方法對DT389-IL13進行柱上復性及初步純化，然后使用離子交換色譜方法進一步純化［25］。

2.4 重組白喉毒素的篩選 人類基因組計劃的開展和組合化學庫技術的發(fā)展，使用高通量篩選，成為各制藥企業(yè)和研究機構搶占市場、加快藥物研發(fā)步伐的首選［26］。定量的高通量篩選測量細胞內(nèi)吞作用和ab內(nèi)酰胺酶致死因，為避免致死的炭疽毒素和白喉毒素可利用阻礙炭疽毒素內(nèi)化的小分子的識別一些小分子保護RAW264.7巨噬細胞和中國倉鼠卵巢細胞［27］。

3 臨床應用

3.1 重組白喉毒素的活性實驗 重組白喉毒素的動物實驗報道多、療效好、可使荷瘤小鼠完全治愈，副作用低，動物實驗表明DT/GM-CSF可抑制裸鼠體內(nèi)移植性AML細胞的生長［28］。荷瘤裸鼠實驗表明，重組毒素的療效與使用方法有關，隔2 d注射共5次最為有效。在SCID鼠、大鼠、猴上均有效［29］，而且局部應用重組毒素療效優(yōu)于全身應用［30］。應用含有白喉毒素A片段(DTA)融合脂質(zhì)體對肉瘤(S-180)細胞進行體內(nèi)、體外殺傷實驗，結果表明ddy鼠實驗組比對照組多存活60 d［31］。對于用裸鼠建立的乳腺癌MCF-7細胞移植瘤模型應用瘤內(nèi)注射法給予重組質(zhì)粒PGL3-DF3-DTA治療，治療結果表明重組質(zhì)粒PGL3-DF3-DAT可以明顯減少腫瘤體積，抑瘤率為50.08%［32］，DT390-biTMTpl融合蛋白通過抑制腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞壞死，發(fā)揮抑制裸鼠皮下瘤的生長作用［33］。

3.2 白喉毒素的免疫實驗 白喉毒素能夠和細菌鞭毛蛋白共同刺激IL-17生產(chǎn)胸腺細胞，作為免疫細胞群對微生物組件做出快速反應［28］;白喉毒素介導的免疫應答應用于對胃腸道細菌感染研究的CD11c-DTRtg模型中［19］;能損害哺乳動物的大多數(shù)器官，如心臟、肝臟、肺和腎臟。具有生化和生物學特性的交叉反應的材料197(CRM197)與白喉毒素的無毒突變體的偶聯(lián)蛋白可以作為疫苗或其他潛在的臨床應用［34］。

3.3 腫瘤的靶向治療 腫瘤靶向蛋白是由毒素酶制劑與能與癌癥相關抗原結合的細胞特定結合域結合形成的，靶向毒素的抗腫瘤治療有其天然副作用，靶向治療應用于人類的前景取決于其副作用的減少，一些植物次級代謝產(chǎn)物(皂苷)被證明能增加表皮生長因子受體為靶向毒素的功效，并且在很大程度上減少副作用［35］。

3.4 白喉毒素對動物的藥用研究 以白喉毒素為基礎的免疫毒素與很多臨床的應用相關，猴、家兔、豚鼠以及家禽等的組織細胞對白喉毒素均敏感，因此白喉毒素作為殺害鼠類的藥物具有一定空間［21］。如自身免疫疾病的治療和器官移植耐受性，已存在的抗白喉毒素抗體，要求在接種抗白喉毒素或者被白喉桿菌感染后，能干涉或者抑制這些抗免疫毒素的功能［5］。

3.5 白喉毒素對動物的細胞研究 以白喉毒素為基礎的免疫毒素常用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤、白血病惡性腦瘤、肝癌等［36］，白喉毒素對許多動物的致死率極高，如家兔、豚鼠及靈長類。將這些致死劑量換算到人類大約是0.1 μg/kg 體重［16］，如 DAB389IL-2能通過顯著降低脊髓病變細胞內(nèi)的CD4+，CD8+，CD25+，TCRγδ+表型和 CD11b+巨噬細胞數(shù)量［37］，來抑制小鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎［38］;389-hIL13-13E13K(白介素13和白喉毒素的融合蛋白)能靶向地殺滅肝癌細胞，為肝癌治療提供一個新的策略或者一個可供選擇的方案［39］。

3.6 重組白喉毒素的臨床研究 除了已經(jīng)被FDA批準的 ONTAK(DAB389-IL-2)外［7］，還有一系列的白喉毒素類免疫毒素已經(jīng)進入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗階段:應用于急性髓系白血病的DT388-GM-CSF進入Ⅰ期臨床等［40］。如應用于上皮癌的DAB389-TGF-α已進入Ⅲ期臨床，應用于骨髓瘤細胞的DAB390-IL-6進入Ⅲ期臨床［41］;用于乳腺癌的DAB389-EGF應用于Ⅱ期臨床［41］。

由于重組毒素的活性都要通過動物體體現(xiàn)功效，而且實驗表明每一種重組毒素都會產(chǎn)生一定的特異性活性，可見重組白喉毒素由于具有高特異性、高細胞毒活性，無疑是動物腫瘤和人類治療的主要方面。雖然目前上市的重組白喉毒素類只有ONTAK(DAB389-IL2)，應用的經(jīng)驗與知識尚不夠豐富，但是針對各種細胞表面特征分子的相關免疫毒素的研究報道層出不窮，一些免疫毒素在臨床試驗的Ⅰ、Ⅱ期顯示了對化療耐藥性和難治愈癌癥的明顯抗癌活性。

4 小結與展望

由于重組白喉毒素類是通過細胞表面受體內(nèi)化到靶細胞上的，因此腫瘤細胞表面受體的高度表達是免疫毒素具有較高抗腫瘤活性的關鍵，應考慮到如何選擇最恰當?shù)姆椒ㄟB接靶向部分和毒性部分。連接方法的恰當與否直接關系著白喉類重組免疫毒素的穩(wěn)定性、靶向能力和毒性效力?？衫貌煌膶蛞蜃樱煌倪B接方法連接到白喉毒素，構建不同的重組白喉毒素，達到治療不同疾病的功效，實現(xiàn)重組毒素特異性強的特點，減少白喉毒素的免疫原性，達到降低或消除其副作用的目的。另外通過調(diào)節(jié)細胞表面靶點的表達促進白喉毒素類免疫毒素的作用，尋找靶細胞上特異的靶點，包括對決定載體及毒素分子免疫原性的部位進行定位突變或基因刪除等修飾，選擇小分子量的毒素，開發(fā)人源化的載體選擇恰當?shù)倪B接子以提高載體和毒素分子的穩(wěn)定性。

綜上所述，開發(fā)親和力強而細胞內(nèi)毒副反應弱的融合蛋白是重組白喉毒素構建和臨床應用的重要方向。而且重組白喉毒素也可以在治療動物的免疫疾病和腫瘤盡顯功效。盡管白喉毒素類免疫毒素靶向治療腫瘤尚存在一些問題，但隨著蛋白質(zhì)及基因工程技術的發(fā)展，重組白喉毒素類免疫毒素將有望成為治療惡性腫瘤的有效手段。相信具有高效、特異性強的白喉毒素類藥物在癌癥治療的臨床應用上將有著更大的發(fā)展空間和更廣闊的應用前景。

［1］Fernando Fratelli，José Abrah?o-Neto，Aline Tojeira Prestia Caricati.native method for purifying and detoxifying diphtheria toxin［J］.Toxin，2011，(57):1093-1100.

［2］Shinji Kakimoto，Toshizumi Tanabe，Hideki Azuma.Enhanced internalization and endosomal escape of dual-functionalized poly(ethyleneimine)s polyplex with diphtheria toxin T and R domains［J］.Biomedicine＆ Pharmacotherapy，2010，(64):296-301.

［3］潘 晟，黃文廣.重組質(zhì)粒PGL3-DF3-DTA對乳腺癌荷瘤裸鼠的治療研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學，2006，16(24):3739-3741.

［4］Yi Zhang，Schulte Wendy，Pink Desmond.Sensitivity of Cancer Cells to Truncated Diphtheria Toxin［J］.PLoS ONE，2010，5(5):1-5.

［5］Rama Shanker Verma，Sirisha Potala，Mrudula Mathew.Microorganisms in Sustainable Agriculture and Biotechnology［M］.Springer Netherlands，2012:647-662.

［6］Charles F LeMaistre.Commentary on“DAB389IL-2(ONTAK):A Novel Fusion Toxin Therapy for Lymphoma”［J］.Clinical Lymphoma，2000，1(2):117.

［7］C Frederick LeMaistre.DAB389IL-2(Denileukin Diftitox，ONTAK):Other Potential Applications［J］.Clinical Lymphoma，2000，1(1):37-40.

［8］Abraham J Matar，Vimukthi Pathiraja，Zhirui Wang.Effect of pre-existing anti-diphtheria toxin antibodies on T cell depletion levels following diphtheria toxin-based recombinant anti-monkey CD3immunotoxin treatment［J］.Transplant Immunology，2012，27(1):52-54.

［9］馬湘一，葉雙梅，張逸群，等.重組腫瘤導向肽RGD-白喉毒素DT390融合蛋白的原核表達及鑒定［OL］.［2012-06-05］.http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201206-72.

［10］Xiangyi Ma，Peng Lv，Shuangmei Ye.DT390-triTMTP1，a Novel Fusion Protein of Diphtheria Toxin with Tandem Repeat TMTP1 Peptide，Preferentially Targets Metastatic Tumors［J］.Molecular Pharmaceutics，2013，10(1):115-126.

［11］Dana Litvak-Greenfeld，Itai Benhar.Risks and untoward toxicities of antibody-based immunoconjugates［J］.Advanced Drug Delivery Reviews，2012，64(15):1782-1799.

［12］Jaclyn Stromp Peraino，Marian Schenk，Huiping Zhang.A truncated diphtheria toxin based recombinant porcine CTLA-4 fusion toxin［J］.Journal of Immunological Methods，2013，391(1):103-111.

［13］Daniel A Vallera，Deborah Todhunter，David W Kuroki.Molecular modification of a recombinant，bivalent anti-human CD3 immunotoxin(Bic3)results in reduced in vivo toxicity in mice［J］.Leukemia Research，2005，29(3):331-341.

［14］Daniel A Vallera，Hua Chen，Andrew R.Sicheneder.Genetic alteration of a bispecific ligand-directed toxin targeting human CD19 and CD22 receptors resulting in improved efficacy against systemic B cell malignancy［J］.Leukemia Research，2009，33(9):1233-1242.

［15］湯嬌雯.基因工程制藥的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景［J］.生物技術通報，2009，(8):22-31.

［16］Jaclyn Stromp Peraino，Marian Schenk，Guoying Li.Development of a diphtheria toxin-based recombinant porcine IL-2 fusion toxin for depleting porcine CD25+cells［J］.Journal of Immunological Methods，2013，398:33-43.

［17］Yunpeng Su，Shi-Yan Li，Sunil Ghosh.Characterization of variant diphtheria toxin-interleukin-3fusion protein，DTIL3K116W，for phase I clinical trials［J］.Biologicals，2010，38(1):144-149.

［18］Sirisha Potala，Rama S Verma.Modified DT-IL2 fusion toxin targeting uniquely IL2 expressing leukemia cell lines-Construction and characterization［J］.Journal of Biotechnology，2010，148(3):147-155.

［19］Michaela Feuring-Buskea，Arthur Frankel，Brigitte Gerhard.Variable cytotoxicity of diphtheria toxin 388-granulocytemacrophage colony-stimulating factor fusion protein for acute myelogenous leukemia stem cells Experimental Hematology［J］.Exp Hematol，2000，28(12):1390-1400.

［20］Mahendra K Bhopalea，Brendan Hilliard，Cris S.Constantinescu.DAB389IL-2 suppresses autoimmune inflammation in the CNS and inhibits T cell-mediated lysis of glial target cells［J］.Experimental and Molecular Pathology，2013，Jul 17.［Epub ahead of print］.

［21］Wenjie Chen，Hong Li，Yi Jia.In vivo administration of plasmid DNA encoding recombinant immunotoxin DT390-IP-10 attenuates experimental autoimmune encephalomyelitis［J］.Journal of Autoimmunity，2007，28:30-40.

［22］Fernando Fratellia，José Abrah?o-Netoc，Aline Tojeira Prestia Caricati.An alternative method for purifying and detoxifying diphtheria toxin［J］.Toxicon，2011，57(7/8):1093-1100.

［23］代新憲，鄭妍鵬，郭韶霞，等.重組毒素DT389-IL13的復性與純化工藝［J］.北京交通大學學報，2010，34(6):118-127.

［24］Fattah，Shihui，Liu，Stephen H.Recombinant expression and purification of a tumor-targeted toxin in Bacillus anthracis［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2013，430(1):150-155.

［25］徐偉文，李文全.高通量藥物靶位基因篩選的策略與方法［J］.中國藥學雜志，2002，37(4):241-243.

［26］Kelly D Stone，Henry A Feldman，Charlotte Huisman.Analysis of in vitro lymphocyte proliferation as a screening tool for cellular immunodeficiency［J］.Clinical Immunology，2009，131(1):41-49.

［27］Frankel A E，Beran M，Hogge D E，et al.Malignant progenitors from patients with CD87+acute myelogenous leukemia are sensitive to a diphtheria toxin-urokinase fusion protein［J］.Exp Hematol，2002，30:1316-1323.

［28］Hall P D，Razzouk B I，Willoughby T E，et al.The majority of children and adolescents with acute myeloid leukemia have detectable anti-DT388-GMCSF IgG concentrations，but at concentrations that should not preclude in vivo activity［J］.J Pediatr Hematol Oncol，2002，24:521-526.

［29］Coken K A，Liu T，Bissonette R，et al.DAB389-EGF fusion protein therapy of refractory glioblastoma multiforme［J］.Curr Pharm Biotechnol，2003，4:39-49.

［30］Thorburn J，F(xiàn)rankel A E，Thorburn A.Apoptosis by leukemia cell-targeted diphtheria toxin occurs via receptor-independent activation of fas-associated death domain protein［J］.Clin Cancer Res，2003，9:861-865.

［31］Buzzi S，Rubboli D，Buzzi G，et al.CRM197(nontoxic diphtheria toxin):effects on advanced cancer patients［J］.Cancer Immunol Immunother，2004，53(11):1041-1048.

［32］Andreas Weber1，Corinna Zimmermann1，Gerd Meyer zu H?rste.Bacterial flagellin and diphtheria toxin co-stimulate IL-17-producing thymocytes［J］.Cytokine，2013，64(1):221-226.

［33］Linda Westermark，Anna Fahlgren，Maria F?llman.Immune responseto diphtheria toxin-mediated depletion complicates the use of the CD11c-DTRtg model for studies of bacterial gastrointestinal infections［J］.Microbial Pathogenesis，2012，53(3/4):154-161.

［34］Michael Br?ker，Paolo Costantino，Lisa DeTora.Biochemical and biologicalcharacteristics ofcross- reacting material197(CRM197)，a non-toxic mutant of diphtheria toxin:Use as a conjugation protein in vaccines and other potential clinical applications［J］.Biologicals，2011，39(4):195-204.

［35］Alexander Weng，Mayank Thakur，F(xiàn)igen Beceren-Braun.The toxin component of targeted anti-tumor toxins determines their efficacy increase by saponins［J］.Molecular Oncology，2012，6(3):323-332.

［36］S.Michael Phillipsb，Mahendra K Bhopalec，Brendan Hilliard.Suppression of murine experimental autoimmune encephalomyelitis by interleukin-2 receptor targeted fusion toxin，DAB389IL-2［J］.Cellular Immunology，2010，261(2):144-152.

［37］Lingling Hou，Juan Du，Jianwei Wang.Expression of IL-13Rα2 in liver cancer cells and its effect on targeted therapy of liver cancer［J］.Cancer Research and Clinical Oncology，2010，136(6):839-846.

［38］FitzGerald D J，Kreitman R，Wilson W，et al.Recombinant immunotoxins for treating cancer ［J］.Int J Med Microbiol，2004，293(7/8):577-582.

［39］Coken K A，Liu T，Bissonette R，et al.DAB389-EGF fusion protein therapy of refractory glioblastoma multiforme［J］.Curr Pharm Biotechnol，2003，4:39-49.

［40］Senchenkov A，Han T Y，Wang H，et al.Enhanced ceramide generation and induction of apoptosis in human leukemia cells exposed to DT(388)-granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)，a truncated diphtheria toxin fused to human GM-CSF ［J］.Blood，2001，98:1927-1934.

［41］Swati Choudhary，Mrudula Mathew，Rama S，et al.Therapeutic potential of anticancer immunotoxins［J］.Drug Discovery Today，2011，16(12):495-501.