藍(lán)琳友 洪溪屏 蔡元暉

腦卒中目前是全球第2常見死因，在我國已成為第1位死因，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中的大部分，而缺血再灌注損傷是大多數(shù)缺血性腦血管疾病的主要病理生理過程，其發(fā)生機制尚未完全闡明［1］。有研究表明，缺血后神經(jīng)元細(xì)胞凋亡參與了缺血性腦損傷的過程［2］。因此，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡可減輕腦缺血損傷。

西洛他唑是一種選擇性磷酸二酯酶3抑制劑，可通過增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷腺苷酸含量和激活蛋白激酶A從而發(fā)揮抗血小板凝聚和舒張血管的作用，本研究擬觀察西洛他唑?qū)Υ笫缶衷钚阅X缺血再灌注損傷模型中神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響及其作用機制［3］。

材料與方法

1．動物和材料:成年雌性 SD 大鼠，體重304．5 ±25．4g，由溫州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供;西洛他唑(純度＞98%)購自Sigma公司;免疫組化染色試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)研究所;Tunel試劑盒購自瑞士羅氏公司;caspase-3、p-P38、p-ERK、p-JNK和β-actin抗體購自美國Epitomics公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Sigma公司。

2．動物分組和模型制備:將SD大鼠按照數(shù)字表法隨機分成5組:假手術(shù)組、模型組、西洛他唑低劑量(5mg/kg)組、西洛他唑中劑量(10mg/kg)組和西洛他唑高劑量(20mg/kg)組，每組15只。按照Longa EZ等報道的線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動脈閉塞模型，以動物出現(xiàn)右眼Horner征為模型成功的標(biāo)志，阻斷血流2h后再灌注24h，成功建立缺血再灌注模型45只［5］。假手術(shù)組僅將縫線插入后拔出，不阻斷大腦中動脈。西洛他唑在術(shù)前2h和6h分別經(jīng)灌胃給藥1次，模型組和假手術(shù)組分別灌胃給予等量生理鹽水。

3．神經(jīng)功能評分:所有實驗大鼠在手術(shù)清醒后自由飲食，術(shù)后4、24和48h根據(jù)Longa EZ法分別進(jìn)行神經(jīng)功能評分:0分，無明顯神經(jīng)功能缺損;1分，提尾時不能伸展左前肢;2分，行走時向左側(cè)旋轉(zhuǎn);3分，行走時向左側(cè)傾斜;4分，不能自主活動或伴意識障礙。大鼠清醒后首次評分在1～3分者為造模成功，作為本次實驗用大鼠。

4．Tunel法檢測細(xì)胞凋亡:術(shù)后24h每組隨機取5只大鼠同時腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛麻醉后，迅速開胸，用PBS灌注后用多聚甲醛灌注固定，取出腦組織后剔除小腦、腦干和嗅球取出腦組織，一半放置液氮中保存，一半置4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚3μm，烘干備用。細(xì)胞凋亡檢測按Tunel試劑盒說明書操作，細(xì)胞核固縮、染色體凝集呈棕褐色染色者為凋亡細(xì)胞，低倍鏡(×100)下觀察20個視野，圖片結(jié)果用Image-Pro Plus 6．0圖像處理軟件進(jìn)行分析。

5．Western blot法檢測腦組織中蛋白的表達(dá):將液氮中保存的腦組織粉碎后加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取上清液。用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質(zhì)樣品(20微克/

結(jié) 果

1．各組神經(jīng)功能缺損評分:與假手術(shù)組相比較，模型組各時間點神經(jīng)功能評分均顯著升高，在24h時達(dá)到高峰(P＜0．05)。與模型組相比較，西洛他唑各劑量組在各時間點神經(jīng)功能評分均降低(P＜0．05)。與西洛他唑低劑量組相比較，西洛他唑高劑量組神經(jīng)功能評分低于低劑量組，各時間點差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0．05，表1)。

表1 各組大鼠在不同時間點的神經(jīng)功能評分比較(±s，n=5，分)

表1 各組大鼠在不同時間點的神經(jīng)功能評分比較(±s，n=5，分)

與模型組比較，*P＜0．05;與西洛他唑低劑量組比較，#P＜0．05

4h 24h 48h假手術(shù)組 0．00 ±0．00* 0．00 ±0．00* 0．00 ±0．00組別*模型組 2．20 ±0．45 2．80 ±0．58 2．60 ±0．35西洛他唑低劑量組 1．50 ±0．24* 1．90 ±0．34* 1．50 ±0．30*西洛他唑中劑量組 1．40 ±0．30* 1．50 ±0．45* 1．45 ±0．35*西洛他唑高劑量組 0．60 ±0．24*# 0．80 ±0．25*# 0．50 ±0．12*#

2．Tunel法檢測神經(jīng)細(xì)胞凋亡:如圖1所示，Tunel染色陽性細(xì)胞表現(xiàn)為僅為胞核染成棕褐色，圖片經(jīng)過Image-Pro Plus 6．0圖像處理軟件分析后，Tunel陽性細(xì)胞比例用累積光密度值IOD來表示。假手術(shù)組中有少量凋亡細(xì)胞，模型組中可見大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡，顯著高于假手術(shù)組(P＜0．05);西洛他唑低、中、高劑量組的細(xì)胞凋亡率均低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05);與西洛他唑低劑量組相比較，西洛他唑中、高劑量組的IOD值均明顯下降，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0．05)，詳見表2。

3．西洛他唑?qū)Υ笫竽X組織細(xì)胞MAPK信號通路中p-P38、p-ERK、p-JNK以及 caspase-3蛋白表達(dá)的影響:如圖2所示，與假手術(shù)組相比較，模型組中MAPK信號通路調(diào)節(jié)蛋白p-P38、p-ERK和 p-JNK以及caspase-3的表達(dá)均顯著增加;與模型組相比較，西洛他唑作用后大鼠腦組織中p-P38的表達(dá)水平降低，呈濃度依賴性，而西洛他唑?qū)ζ渌鸐APK的調(diào)節(jié)蛋白如p-ERK和p-JNK的表達(dá)無明顯變化;同時隨著西洛他唑劑量的增加，caspase-3的表達(dá)明顯下降，且表達(dá)強度隨藥物劑量的增加而降低(表3)。

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果(×100)

表2 Tunel法檢測各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的IOD值比較(±s)

表2 Tunel法檢測各組大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的IOD值比較(±s)

與模型組比較，*P＜0．05;與西洛他唑低劑量組比較，#P＜0．05

組別 IOD值假手術(shù)組 34．59 ±6．19*模型組 254．51 ±35．45西洛他唑低劑量組 156．35 ±20．69*西洛他唑中劑量組 94．31 ±15．81*#西洛他唑高劑量組 61．29 ±8．24*#

圖2 Western blot檢測各組大鼠腦組織中p-P38、p-ERK、p-JNK以及caspase-3蛋白表達(dá)

表3 各組大鼠腦組織p-P38、p-ERK、p-JNK以及caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

表3 各組大鼠腦組織p-P38、p-ERK、p-JNK以及caspase-3蛋白表達(dá)比較(±s)

與模型組比較，*P＜0．05;與西洛他唑低劑量組比較，#P＜0．05

p-P38 p-ERK p-JNK caspase-3手術(shù)組 1．00 ±0．00* 1．00 ±0．00*1．00 ±0．00*1．00 ±0．00組別*模型組 2．45 ±0．24 3．18 ±0．52 2．49 ±0．27 3．75 ±0．61西洛他唑低劑量組 1．62 ±0．29* 3．34 ±0．59 2．64 ±0．42 2．51 ±0．34*西洛他唑中劑量組 1．07 ±0．16*#3．27 ±0．43 2．67 ±0．31 1．62 ±0．25*#西洛他唑高劑量組 0．84 ±0．19*#3．48 ±0．49 2．59 ±0．46 1．31 ±0．14*#

討 論

腦缺血再灌注后可產(chǎn)生一系列神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，嚴(yán)重危害患者的生活質(zhì)量，Longa EZ法是在臨床和科研實驗中被廣泛應(yīng)用的神經(jīng)功能評分法。在本研究中，模型組大鼠出現(xiàn)明顯對側(cè)肢體運動障礙和意識障礙等神經(jīng)功能損害的表現(xiàn)，而假手術(shù)并未引起缺血再灌注，因此沒有出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，從而排除手術(shù)因素對大鼠神經(jīng)學(xué)評分的影響，而西洛他唑可以有效改善缺血再灌注大鼠的神經(jīng)癥狀，表明西洛他唑?qū)Υ笫笕毖俟嘧p傷有確切的保護(hù)作用，與文獻(xiàn)報道相符［4］。

腦組織缺血再灌注后繼發(fā)的病理生理改變所造成腦細(xì)胞的損傷是腦缺血再灌注損傷的重要原因，研究表明，細(xì)胞凋亡是引起受損腦細(xì)胞死亡的主要機制之一，而海馬CA1區(qū)是大腦缺血最為敏感的部位，被稱為缺血易損區(qū)［5，6］。因此，本研究采用該處腦組織進(jìn)行腦缺血再灌注損傷的研究。Tunel實驗結(jié)果表明，模型組大鼠腦組織中凋亡細(xì)胞數(shù)較假手術(shù)組明顯增多，而西洛他唑作用后腦組織中凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)顯著減少，并呈劑量依賴性，表明西洛他唑?qū)Υ笫竽X組織中神經(jīng)細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的過程，目前已知細(xì)胞凋亡有兩條主要途徑［7］:一是TNF受體家族成員參與的通過caspase-8活化途徑，稱為外源性凋亡途徑;二是細(xì)胞色素C參與的通過caspase-9活化的途徑，稱為內(nèi)源性凋亡途徑，兩條途徑最后均激活下游效應(yīng)因子caspase-3和caspase-7從而使細(xì)胞發(fā)生凋亡。但除外caspase依賴的細(xì)胞凋亡通路外，還存在不依賴caspase的凋亡通路，如MAPK信號通路。MAPK是細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/酪氨酸蛋白激酶家族。MAPK信號通路中的成員P38、ERK和JNK等可以被各種細(xì)胞外信號激活，引起細(xì)胞內(nèi)的級聯(lián)反應(yīng)，從而參與細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等一系列生理及病理過程。大量研究表明，阻斷JNK通路可抑制細(xì)胞凋亡，而阻斷ERK通路可促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而P38作為MAPK家族中最重要成員，P38的絲氨酸/酪氨酸殘基可以被磷酸化而激活為p-P38，從而在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用，p-P38表達(dá)增加可促進(jìn)細(xì)胞凋亡［7，8］。在本研究中，應(yīng)用 Western blot法檢測了MAPK家族中3種調(diào)節(jié)蛋白的變化，結(jié)果表明，模型組中p-P38、p-ERK、p-JNK以及 caspase-3的表達(dá)較假手術(shù)組明顯增加，表明在缺血再灌注中，caspase通路和MAPK通路可能都參與了神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程;而經(jīng)西洛他唑作用后p-P38表達(dá)水平顯著降低，而p-ERK、p-JNK的表達(dá)并沒有發(fā)生改變，而caspase-3的表達(dá)也經(jīng)西洛他唑作用后降低。由此表明，抑制caspase-3的表達(dá)以及阻斷P38 MAPK信號通路的激活可能是西洛他唑抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機制之一。

總之，本次研究表明西洛他唑可通過抑制腦組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時對大鼠缺血再灌注神經(jīng)功能損傷發(fā)揮一定保護(hù)作用，其機制可能主要是通過抑制caspase-3的表達(dá)以及阻斷P38 MAPK信號通路的激活而實現(xiàn)。本次實驗結(jié)果為西洛他唑應(yīng)用于臨床治療提供了更多的實驗依據(jù)，但需進(jìn)一步實驗研究西洛他唑調(diào)節(jié)MAPK信號通路的具體機制。

1 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會腦血管病學(xué)組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組．中國急性缺血性腦卒中診治指南2010［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(35):4013-4017

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