王書宏 徐琳 顏麗麗

大電導(dǎo)鈣激活鉀通道β1亞基與子癇前期的相關(guān)性研究

王書宏①徐琳①顏麗麗②

目的：探討胎盤組織和子宮平滑肌組織中大電導(dǎo)鈣激活鉀通道β1亞基（KCNM β1）的表達(dá)，及其與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。方法：輕、重度子癇前期組（研究組）和正常孕婦組（對(duì)照組）孕婦的胎盤組織及子宮平滑肌組織中KCNM βl mRNA的表達(dá)通過熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)。采用ELISA法檢測(cè)三組孕婦血清KCNM βl濃度變化水平。結(jié)果：各研究組中孕婦血清的KCNM βl水平、胎盤組織及子宮平滑肌中KCNM βl mRNA表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而輕、重度子癇前期組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：孕婦血清中KCNM βl表達(dá)降低，胎盤組織和子宮平滑肌中KCNM βl mRNA的表達(dá)降低與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)，可能參與了子癇前期的病理生理過程。

子癇前期； 大電導(dǎo)鈣激活鉀通道β1亞基； 胎盤； 子宮平滑??； 血清

子癇前期是妊娠期高血壓疾病最常見的類型，其發(fā)病率為5%～10%，其導(dǎo)致孕產(chǎn)婦的死亡總數(shù)僅次于產(chǎn)后出血和羊水栓塞。目前妊娠期高血壓疾病至今病因不明，有研究將高血壓病視為一種細(xì)胞膜疾病，高血壓的產(chǎn)生是由于大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（highconductance calcium activated potassium channels，BKca）的缺陷，不能反饋相應(yīng)代償作用，而導(dǎo)致動(dòng)脈平滑肌膜電位極化障礙，使血管緊張性增高，促進(jìn)高血壓的產(chǎn)生[1]。大電導(dǎo)鈣激活鉀通道β1亞基（KCNM β1）與子癇前期的相關(guān)性目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)研究，本研究通過孕婦血清中KCNM βl的表達(dá)及胎盤組織和子宮平滑肌中KCNM βl mRNA的表達(dá)，探討KCNM βl與子癇前期發(fā)病的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年2月-2013年2月在本院剖宮產(chǎn)分娩的輕、重度子癇前期孕婦為研究組，輕、重度組各19例；選取同期正常妊娠孕婦20例為對(duì)照組。子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照豐有吉主編的第7版8年制《婦產(chǎn)科學(xué)》[2]。研究組患者均符合以下條件：（1）產(chǎn)婦年齡在26～34歲之間；（2）無(wú)高血壓病史及家族史。對(duì)照組患者均符合以下條件：（1）產(chǎn)婦年齡在24～34歲之間；（2）無(wú)高血壓疾病家族史；（3）妊娠期間血壓監(jiān)測(cè)記錄一直保持在正常范圍，即BP<140/90 mm Hg。本次妊娠均為單胎，研究組的孕婦既往無(wú)高血壓病及慢性腎炎病史。兩組孕婦的年齡、分娩孕周比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。所有孕婦在研究前均簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 試劑和實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 主要試劑及儀器 Total RNA提取試劑（Trizol）和熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本Takara公司，DNA Maker購(gòu)自北京百泰克生物有限公司，GelRed熒光核酸染色試劑（Unired）購(gòu)自美國(guó) Biotium公司。KCNM βl引物由上海生工生物工程有限公司合成，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA試劑盒）購(gòu)自青島浩賽科技有限公司，所有標(biāo)本同批測(cè)定，批內(nèi)變異<6%。上海瑞儀公司PCR擴(kuò)增儀。德國(guó)Eppendorf公司常溫微量離心機(jī)。

1.2.2 標(biāo)本采集 術(shù)前抽取所有孕婦空腹靜脈血并分離血清保存，以檢測(cè)血清中KCNMβl的濃度。剖宮產(chǎn)術(shù)中取胎盤組織約2 cm×2 cm×2 cm大小，再取一塊子宮平滑肌各約1 cm×1 cm×1 cm大小，分別置于EP管中，冷凍保存以提取RNA。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）血清KCNM βl測(cè)定：采用ELISIA法，于回歸方程上計(jì)算所測(cè)樣本的OD值所對(duì)應(yīng)的樣品濃度。所有標(biāo)本同批測(cè)定，批內(nèi)變異<6%。（2）子宮平滑肌組織和胎盤組織中的KCNMβl mRNA的提取及測(cè)定：所取到的組織通過熒光定量PCR法測(cè)定總RNA，嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行檢測(cè)。取波長(zhǎng)260 nm及280 nm的紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA樣品的純度及濃度，并稀釋后經(jīng)l.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外線下得到完整的5S、18S及28S三條RNA條帶。（3）熒光定量PCR：PCR引物參考國(guó)內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)，設(shè)計(jì)KCNM βl的PCR引物序列，并與Gene Bank中的基因譜一一核對(duì)無(wú)誤。PCR引物序列及長(zhǎng)度見表1。引物稀釋至濃度為20 μmol/L，在Microtube管中配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液（詳見表2），并在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。按表1.4配制PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。熒光定量PCR反應(yīng)體系：SYBR Primix Ex TaqTMⅡ10 μL、上下游引物各0.8 μL，超純水6.4 μL，cDNA產(chǎn)物2.0 μL；PCR擴(kuò)增條件為：（1）預(yù)變性95 ℃、30 s，1 個(gè)循環(huán)；（2）95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)；（3）95 ℃、0 s，65 ℃、15 s，95 ℃、0 s。熒光定量PCR檢測(cè)得到各基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率。電泳結(jié)果用紫外線凝膠自動(dòng)成像分析儀進(jìn)行掃描、分析擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度和序列，以及擴(kuò)增的特異性。熒光定量PCR檢測(cè)得到各基因引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率。

表1 PCR引物序列及長(zhǎng)度

表2 轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液列表

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組織中KCNM βl表達(dá)水平采用直線相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 三組孕婦血清中KCNM βl水平的比較 輕度子癇前期組血清KCNMβl為（85.02±55.67）pg/mL，重度子癇前期組為（72.32±49.92）pg/mL，對(duì)照組為（150.13±76.17）pg/mL。輕、重度子癇前期組血清血清KCNM βl的表達(dá)結(jié)果與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.51，P<0.05；t=0.43，P<0.05），前兩組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 三組孕婦胎盤組織中KCNM βl mRNA表達(dá)水平的比較 輕、重度子癇前期組胎盤組織中KCNM βl mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.69、17.11，P<0.05）；但輕、重度子癇前期組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.73，P>0.05），見表3。

2.3 三組孕婦子宮平滑肌組織中KCNM βl mRNA表達(dá)水平的比較 輕、重度子癇前期組子宮平滑肌中KCNM βl mRNA表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.75、t=7.40，P<0.05）；但輕、重度子癇前期組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.70，P>0.05），見表3。

2.4 同組孕婦胎盤與子宮平滑肌組織中KCNM βl表達(dá)水平的比較 子宮平滑肌及胎盤組織中血清KCNM βl表達(dá)水平采用直線相關(guān)分析法，得出r=0.2。提示各組組織中血清KCNM βl表達(dá)水平不相關(guān)。

表3 各組胎盤及子宮平滑肌中KCNMβl的表達(dá)（）

表3 各組胎盤及子宮平滑肌中KCNMβl的表達(dá)（）

*與對(duì)照組比較，P<0.05

組別 胎盤KCNMβl mRNA子宮平滑肌KCNMβl mRNA重度子癇前期組（n=19） 2.45±1.55 1.36±1.07*輕度子癇前期組（n=19） 3.45±1.09 1.86±0.51*對(duì)照組（n=20） 4.53±1.00 4.32±4.73

3 討論

子癇前期是以妊娠期高血壓和蛋白尿?yàn)橹饕R床特征，其基本病理生理變化是全身小動(dòng)脈痙攣，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。血管平滑肌細(xì)胞膜上有很多密度不同的鉀通道，其中，鈣激活的鉀通道（KCa）廣泛分布于血管平滑肌細(xì)胞，大電導(dǎo)鈣激活鉀通道（BKca）又稱為Maxi-K channel，是其中的一個(gè)亞類。BKCa通道由結(jié)構(gòu)亞單位α和調(diào)節(jié)亞單位β組成，α-亞單位跨膜區(qū)的片段中包含感受細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化的胞漿域（the cytosolic domain，CTD），而CTD其中之一的K+電導(dǎo)調(diào)節(jié)元件（regulator of K conductance，R CK）即RCK1，因其具有高親和力的Ca2+傳感器，與Ca2+結(jié)合后CTD的構(gòu)型重新排列[3]，是人體BKCa通道Ca2+依賴性激活的基本階段。β-亞單位特別是β1-亞單位因可調(diào)控通道，而增強(qiáng)α-亞單位的功能。BKCa通道功能可因不同組織中β1和α亞單位表達(dá)量的不同而表現(xiàn)出組織的特質(zhì)性。相關(guān)研究表明，大腦中的β1和α亞單位的比例高于身體其他部位，同時(shí)腦血管BKCa通道具有更高的通道開放概率和Ca2+敏感性[4]。而當(dāng)β1-亞單位下調(diào)時(shí)，BKCa通道的開放概率降低，同時(shí)對(duì)Ca2+的敏感性也降低，動(dòng)脈舒張功能受限，成為高血壓等疾病的病理基礎(chǔ)[5]。

平滑肌BKCa通道多表達(dá)β1亞基，提高了平滑肌組織的BKCa對(duì)Ca2+的敏感性，是構(gòu)成細(xì)胞復(fù)極化電流的重要鉀離子通道之一。在正常機(jī)體的生理狀態(tài)下，BKca可因血壓升高而激活[6]，負(fù)反饋調(diào)節(jié)平滑肌收縮，而BKca的超極化可引起血管平滑肌的舒張，微血管的這種舒縮使微循環(huán)血流不會(huì)隨血管內(nèi)壓變化而有太大的改變。

有報(bào)道在KCNM β1基因敲除的小鼠中，其平均動(dòng)脈壓遠(yuǎn)比正常小鼠和α亞基因敲除的小鼠高，而且高血壓表現(xiàn)為進(jìn)行性。提示β1亞單位在調(diào)節(jié)血壓占主導(dǎo)作用，缺失易產(chǎn)生中度高血壓[7]。國(guó)內(nèi)賀同強(qiáng)等[8]報(bào)道，實(shí)驗(yàn)組妊娠期高血壓病疾病孕婦的胎盤血管平滑肌細(xì)胞的鉀電流密度比正常孕婦組減小，提示胎盤細(xì)胞膜上的鉀通道的改變與妊高癥的產(chǎn)生具有密不可分的關(guān)聯(lián)。關(guān)于子癇前期孕婦血清及胎盤組織中KCNM βl水平變化與高血壓的相關(guān)性尚未明確，本研究發(fā)現(xiàn)子癇前期孕婦血清及胎盤組織中KCNM βl表達(dá)均明顯低于正常孕婦，推測(cè)血清中KCNM βl可能通過上述機(jī)制參與子癇前期高血壓的發(fā)生發(fā)展。胎盤組織可能通過胎盤血管參與這一機(jī)制從而參與子癇前期高血壓的發(fā)生發(fā)展。

在平滑肌細(xì)胞中，如血管平滑肌、子宮平滑肌等，BKCa通道通過參與膜電位和肌緊張等生理過程而調(diào)節(jié)平滑肌運(yùn)動(dòng)[9-10]。而子宮平滑肌細(xì)胞的BKCa通道結(jié)構(gòu)中僅含β1亞基，蛋白激酶G（PKG）的磷酸化部位位于β1亞單位上，在妊娠期BKCa通道的β1亞基隨著分布密度、電壓激活及鈣的敏感性的改變來(lái)調(diào)節(jié)平滑肌的收縮。當(dāng)β1亞單位減少，PKG磷酸化減少，而抑制BKCa通道活性，促進(jìn)平滑肌收縮。劉芬等[11]研究結(jié)果表明，敲除β1亞單位進(jìn)行基因，不但BKCa通道的鈣敏感性降低，而且子宮動(dòng)脈的平滑肌張力增加，血壓隨之升高。同時(shí)在孕期由于雌二醇（E2）濃度的不斷增加，子宮平滑肌組織中的β1亞單位的表達(dá)降低[12]。因此可以推測(cè)，子宮平滑肌中KCNM βl水平的降低，可能導(dǎo)致孕婦高血壓的產(chǎn)生。本研究顯示子癇前期孕婦子宮平滑肌中KCNM βl表達(dá)明顯低于正常孕婦，推測(cè)子宮平滑肌中KCNM βl水平降低是通過以上機(jī)制參與了子癇前期高血壓的發(fā)生發(fā)展。

近幾年來(lái)隨著對(duì)BKCa通道的深入研究，發(fā)現(xiàn)其與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有著密切的相關(guān)性。以后的醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)將更進(jìn)一步的研究BKCa通道結(jié)構(gòu)及功能，以便對(duì)妊娠期高血壓疾病及先兆子癇的預(yù)防提供有利證據(jù)，并可望為治療先兆子癇提供新的理論依據(jù)。

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Objective:To investigate the relationship between the pathogenesis of preeclampsia（PE） and the mRNA and protein expression of KCNM β1 subunit in placenta and uterine smooth muscle tissue.Method:The pregnant placenta tissue and KCNM βl mRNA expression in uterine smooth muscle tissue of the mild and severe preeclampsia group （the study group） and the normal pregnant women （the control group） were detected by fluorescent quantitative PCR technique. The serum KCNM βl concentration level changes of three groups pregnant women were detected by ELISA method. Result： The pregnant women’ serum level of KCNM βl， placenta and uterus smooth muscle in KCNM βl mRNA expression levels of the research group were significantly lower than the control group， the difference had statistical significance （P<0.05）； there were no significant difference between the mild and severe preeclampsia group（P>0.05）.Conclusion:KCNM βl expression in serum of pregnant women is reduced， the placenta tissue and smooth muscle of the uterus KCNM βl mRNA expression in lower closely associated with the onset of preeclampsia， may be involved in the pathophysiological process of preeclampsia.

Preeclampsia； Large conductance Ca2+-activated K+-channel β1 subunit； Placenta； Uerine smooth muscle tissue； Blood serum

The Affiliated Hospital of Qingdao University Medical College，Qingdao 266003，China

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.14.003

①青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 山東 青島 266003

②山東省蓬萊市婦幼保健站

徐琳

2014-03-05） （本文編輯：蔡元元）