萬(wàn)濤，黃笛，聞建平

(天津大學(xué)化工學(xué)院，系統(tǒng)生物工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300072)

他克莫司(Tacrolimus，F(xiàn)K-506)是由筑波鏈霉菌(Streptomyces tsukubaensis)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由二十三元環(huán)組成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。他克莫司廣泛應(yīng)用于特應(yīng)性皮炎、變應(yīng)性接觸性皮炎、銀屑病、紅斑狼瘡、扁平苔癬、白癜風(fēng)、Nethenton綜合癥和抑制宿主病等自身免疫疾病的治療［1］。他克莫司商品名為Protopic，于1994年被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，是治療特異性皮炎早期緩解和長(zhǎng)期控制的非甾體類藥物［2］，目前臨床應(yīng)用于預(yù)防肝臟或腎臟移植術(shù)后的移植物排斥反應(yīng)，治療肝臟、胰腺、腎臟、心臟、肺等實(shí)體器官移植術(shù)后應(yīng)用其他免疫抑制藥物無(wú)法控制的移植物排斥反應(yīng)。由于在臨床效果免疫抑制作用比環(huán)孢素A強(qiáng)10～100倍，因而大大降低了臨床使用劑量，同時(shí)不良反應(yīng)也明顯降低。他克莫司市場(chǎng)大部分被歐美國(guó)家占領(lǐng)，開(kāi)發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的他克莫司生產(chǎn)技術(shù)十分必要。

本論文主要對(duì)他克莫司的理化特征和免疫抑制活性、他克莫司微生物發(fā)酵、合成基因簇的研究成果和前體代謝工程的研究狀況進(jìn)行了綜述，同時(shí)結(jié)合系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)對(duì)他克莫司的生產(chǎn)及其基因組尺度代謝工程改造進(jìn)行了展望。

1 他克莫司的理化特征和免疫抑制活性

他克莫司是從鏈霉菌屬(Streptomyces)中分離出的發(fā)酵產(chǎn)物，包括 Streptomyces tsukubaensis，Streptomyces tacrolim icus，Streptomyces sp.ATCC 53770，Streptomyces sp.MA6949，Streptomyces kanamyceticus KCC-S0436，Streptomyces glaucescens，Streptomyces clavuligerus CKD1119。他克莫司是一種很有效的23元大環(huán)內(nèi)酯類新型免疫抑制劑，分子式是 C44H69NO12，相對(duì)分子質(zhì)量為804.02，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1，在常溫下為無(wú)色晶體，難溶于水，易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚、氯仿和丙酮等有機(jī)溶劑。熔點(diǎn)為127～129℃，在不同貯存條件下穩(wěn)定性都較高［2］。

圖1 他克莫司(FK 506)分子式Fig.1 Form u la of Tacrolim us(FK 506)

研究發(fā)現(xiàn)，他克莫司可以有效抑制T淋巴細(xì)胞的誘導(dǎo)作用，能夠抑制淋巴因子 IL-2，IL-3，IFN-Y的產(chǎn)生和IL-2受體的表達(dá)，同時(shí)他克莫司抑制了ConA活性和相同抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞活化，以及淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)［3］。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也證明他克莫司在免疫抑制方面有良好表現(xiàn)，它可以延長(zhǎng)大鼠及狗的心臟、肝臟、腎臟和肢體等抑制器官的存活期，雖然抑制效果與與藥物濃度存在相關(guān)性，但藥物劑量過(guò)大會(huì)產(chǎn)生一定的副作用。小劑量的環(huán)孢霉素或強(qiáng)的松在與他克莫司共同使用時(shí)，可以降低他克莫司的用量，從而減弱其產(chǎn)生的毒性，進(jìn)而增強(qiáng)其免疫抑制作用。臨床發(fā)現(xiàn)，他克莫司能夠明顯減少腎臟移植后出現(xiàn)的急慢性排斥反應(yīng)發(fā)病率，改善手術(shù)后腎臟的功能，并且降低高血脂和高血壓等病癥的發(fā)生率［3］。除此之外，他克莫司還被證實(shí)具有很好的抑制炎癥作用［4］，以及抑制人的肺肥大細(xì)胞或嗜堿性細(xì)胞的組胺或LTC4等炎癥介質(zhì)的釋放。多種炎癥性皮膚病的炎癥介質(zhì)為組胺和前列腺素D2，小劑量他克莫司可以抑制免疫球蛋白E激活人體皮膚肥大細(xì)胞釋放組胺和前列腺素D2。

2 他克莫司的微生物發(fā)酵生產(chǎn)

由于他克莫司的重要醫(yī)用價(jià)值，很多人嘗試著用培養(yǎng)基優(yōu)化的方法提高他克莫司的產(chǎn)量。1984年，日本藤澤公司研究所從日本筑波山土壤中分離的筑波鏈霉菌的發(fā)酵液中提取得到他克莫司的發(fā)酵產(chǎn)率很低，優(yōu)化發(fā)酵條件之后，產(chǎn)率提高了10倍多。之后，進(jìn)行了菌株的改良和發(fā)酵條件的進(jìn)一步優(yōu)化，生產(chǎn)能力提高了幾十倍。1991年，Merck公司對(duì)菌株經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，他克莫司7 d達(dá)到37.8 mg/L。Kumar等［5］從土壤中篩選出一株鏈霉菌，他克莫司產(chǎn)量較高而且副產(chǎn)物極少，誘變后發(fā)酵300 h他克莫司產(chǎn)量最高為5～10 mg/L，該研究組之后在高通氣量的糊精培養(yǎng)基中通過(guò)補(bǔ)料分批發(fā)酵192～279 h，產(chǎn)量達(dá)到 300 ～310 mg/L［6］。

Yoon等［7］研究了初始培養(yǎng)基中添加磷酸鹽、銨鹽和氨基酸等對(duì)菌種合成他克莫司的影響，發(fā)現(xiàn)銨離子的添加雖然可以刺激菌絲生長(zhǎng)、提高葡萄糖和磷酸鹽吸收速率，但是對(duì)他克莫司合成具有阻遏作用，最終利用30 mmol/L的亮氨酸和24.5 mmol/L的乳酸為初始碳源，將他克莫司的產(chǎn)量由12.7 mg/L提高到了18.2 mg/L。Kim等［8］通過(guò)向初始培養(yǎng)基中添加3 g/L玉米油，發(fā)酵8 d將他克莫司的產(chǎn)量由145 mg/L提高到了235 mg/L。該研究還考察了他克莫司發(fā)酵過(guò)程中脂肪酶的酶活性變化，指出該酶在玉米油的誘導(dǎo)下合成，并且在添加葡萄糖后明顯被抑制，證實(shí)脂肪酶與他克莫司發(fā)酵單位成正相關(guān)，暗示高的脂肪酶活性成為他克莫司合成過(guò)程中的重要因子，同時(shí)也證明了油脂作為前體的重要性。他們通過(guò)在200 L發(fā)酵罐放大后最高產(chǎn)量達(dá)到495 mg/L，比生產(chǎn)單位也達(dá)到0.34 g/g菌體干重。Singh等［9］研究了外源添加花生油、大豆油、棉籽油和氨基酸對(duì)于菌種Streptomyces spp.MA6858 B3178合成他克莫司的影響，外源添加30 g/L大豆油和0.2 g/L的賴氨酸，發(fā)酵5 d時(shí)產(chǎn)量由85.8 mg/L提高到103.1 mg/L。同時(shí)，該研究還得出他克莫司在不同碳源發(fā)酵條件下呈現(xiàn)雙階段行為---在開(kāi)始24 h單糖主要用來(lái)合成菌體，36 h后豆油和賴氨酸添加不僅維持菌體生長(zhǎng)，還提高了產(chǎn)物生成，并且培養(yǎng)基pH值起到關(guān)鍵作用。Jung等［10］通過(guò)逐漸提高培養(yǎng)基中他克莫司的濃度(600～1 600 mg/L)來(lái)增加菌株對(duì)產(chǎn)物的耐受性，最終獲得的菌株產(chǎn)量達(dá)到972 mg/L。

目前，國(guó)內(nèi)研究他克莫司主要圍繞自然篩選，原始菌株誘變篩選，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵操作條件等。李玲等［11］采用抑菌圈法初篩得到71株能抑制白色假絲酵母生長(zhǎng)的菌株，高效液相色譜法檢測(cè)代謝產(chǎn)物復(fù)篩，獲得一株他克莫司產(chǎn)生菌株。王秀琴等［12］采用通過(guò)復(fù)合誘變的方法對(duì)出發(fā)菌株筑波鏈霉菌08-6-9進(jìn)行處理，得到一株高產(chǎn)菌株，其搖瓶發(fā)酵水平較出發(fā)菌株提高73.6%。鄭軍榮等［13］應(yīng)用化學(xué)和物理誘變劑對(duì)他克莫司產(chǎn)生菌進(jìn)行菌種誘變，并利用特定的選擇劑(莽草酸和哌可酸及其相應(yīng)的結(jié)構(gòu)類似物)作為選擇壓力篩選出高產(chǎn)突變株，相對(duì)發(fā)酵效價(jià)比出發(fā)菌株提高了約2倍。劉忠［14］通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化了他克莫司產(chǎn)生菌的發(fā)酵培養(yǎng)基，考察了不同的發(fā)酵條件對(duì)他克莫司合成的影響，研究發(fā)現(xiàn)，在5 m3發(fā)酵罐上發(fā)酵144 h他克莫司的的產(chǎn)量可以達(dá)到330 mg/L。

3 他克莫司合成基因簇及其代謝途徑

他克莫司結(jié)構(gòu)復(fù)雜，內(nèi)酯環(huán)由5個(gè)甲基丙二酰、2個(gè)丙二酰、2個(gè)甲氧基丙二酰和1個(gè)烯丙基丙二酰延伸單元組成，環(huán)外的環(huán)己烷來(lái)自分支酸，哌可酸來(lái)自賴氨酸，甲氧基來(lái)自甲硫氨酸。目前，他克莫司生物合成基因簇基因產(chǎn)物的功能已基本得到闡明［15-17］，他克莫司總的合成過(guò)程如圖 2所示，由聚酮合酶(PKS)開(kāi)始聚合前體物，PKS包括 3個(gè)部分---FkbB負(fù)責(zé)分支酸衍生物4，5-二羥基-1-烯基環(huán)己烷羧酸(DHCHC)以及4個(gè)延伸單位(2個(gè)甲基丙二酰輔酶A，1個(gè)丙二酰輔酶A，1個(gè)烯丙基丙二酰輔酶A)的連接和縮化;FkbC有2個(gè)延伸單位(2個(gè)甲基丙二酰輔酶A);FkbA有2個(gè)延伸單位(2個(gè)甲氧基丙二酰輔酶 A，1個(gè)甲基丙二酰輔酶 A，1個(gè)丙二酰輔酶A)。每個(gè)延伸單元伴隨特別的β-酮基延伸步驟，聚酮鏈也對(duì)應(yīng)增長(zhǎng)。FkbA、FkbB和FkbC組成了I型PKS系統(tǒng)，每個(gè)模塊單元包含了幾個(gè)酶結(jié)構(gòu)體:酮酰合酶(KS)，?；D(zhuǎn)移酶(AT)，?；d體蛋白(ACP)，他們用于鏈延伸，同時(shí)部分含有脫水酶(DH)，烯酰還原酶(ER)，酮基還原酶(KR)(圖2)。PKS合成的中間體與FkbP肽合酶催化的哌克酸縮合、成環(huán)。在PKS復(fù)合體釋放后，13元環(huán)進(jìn)入后修飾過(guò)程，C9位被FkbD氧化成酮基官能團(tuán)，C31位被 FkbM甲基化(圖2)。當(dāng) C21位 R官能團(tuán)為甲基，即他克莫司插入的烯丙基丙二酰輔酶A被乙基丙二酰輔酶A替換時(shí)生成產(chǎn)物為子囊霉素(FK520)。當(dāng)C21位R官能團(tuán)雙鍵被加氫，則產(chǎn)物為雙氫他克莫司(FK506D)。

他克莫司生物合成基因簇已經(jīng)被測(cè)序并從實(shí)驗(yàn)證實(shí)了各個(gè)基因所具有的功能，其中，fkbA、fkbB和fkbC負(fù)責(zé)延伸單元的連接和縮化，形成內(nèi)酯環(huán);fkbL負(fù)責(zé)哌可酸的生物合成;fkbP負(fù)責(zé)哌可酸與內(nèi)酯環(huán)連接;tcsA、tcsB、tcsC和 tcsD負(fù)責(zé)烯丙基丙二酰輔酶A的生物合成;fkbD負(fù)責(zé)他克莫司C9的羥基化、氧化，產(chǎn)生 β-羰基酰胺，fkbM負(fù)責(zé) C31的羥基甲基化;fkbG、fkbH、fkb I、fkbJ和 fkbK負(fù)責(zé)甲氧基丙二酰輔酶A的合成;合成起始單元DHCHC是從由分支酸經(jīng)過(guò)fkbO轉(zhuǎn)化而來(lái)［18］(圖3)。他克莫司的生物合成過(guò)程是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，要求一個(gè)高效的調(diào)控機(jī)制來(lái)保證初級(jí)代謝的前體供應(yīng)，以及在PKS上的結(jié)合與催化和PKS的后修飾過(guò)程。除參與合成的必需基因外，在基因簇的兩端還發(fā)現(xiàn)幾個(gè)ORF。通過(guò)基因序列相似性分析，發(fā)現(xiàn) tcs2、tcs7、fkbN編碼的蛋白分別與AsnC、LysR、LAL家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控子序列高度一致，推測(cè)可能起調(diào)控作用。Mo等［19］通過(guò)基因過(guò)表達(dá)、敲除與回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn) tcs2對(duì)他克莫司的合成不起作用，敲除或者過(guò)表達(dá)后都沒(méi)有影響產(chǎn)量;tcs7起負(fù)調(diào)控作用，敲除后他克莫司和副產(chǎn)物子囊霉素產(chǎn)量提高了1.9和1.7倍;fkbN起正調(diào)控作用，調(diào)控因子對(duì)他克莫司的合成是必需的，敲除后菌株失去合成能力。

4 他克莫司菌株代謝工程

4.1 他克莫司前體代謝工程改造及競(jìng)爭(zhēng)途徑敲除

圖2 他克莫司PKS和生物合成結(jié)構(gòu)類似物過(guò)程［16］Fig.2 Schem atic rep resen tation of the PKS and biosynthesis of tacrolim us and its derivatives［16］

圖3 他克莫司生物合成基因簇［16］Fig.3 O rganization of tacrolim us's biosynthetic gene clusters［16］

在前面的介紹中提到，他克莫司由10個(gè)輔酶A縮合而成，因此提高這些輔酶A前體的合成水平可以直接提高他克莫司的產(chǎn)量。其中，甲基丙二酰輔酶A合成途徑有4條:由甲基丙二酰輔酶A變位酶催化的琥珀酰輔酶A異構(gòu)化;通過(guò)丙酰輔酶A羧化酶對(duì)丙酰輔酶A的羧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn);來(lái)自纈氨酸代謝產(chǎn)生的異丁酰輔酶A的多步氧化;丙二酰輔酶A/甲基丙二酰輔酶A連接酶途徑。為了提高前體甲基丙二酰輔酶A的胞內(nèi)水平，Mo等［20］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)原始菌株表達(dá)異源基因甲基丙二酰輔酶A連接酶和差向異構(gòu)酶，丙酰輔酶 A羧化酶和丙酰輔酶 A合酶，他克莫司水平并沒(méi)有提高，但是在過(guò)表達(dá)甲基丙二酰輔酶A變位酶后胞內(nèi)甲基丙二酰輔酶A和他克莫司濃度分別提高3.0和1.5倍。Chen等［15］對(duì)他克莫司合成的2個(gè)稀有前體烯丙基丙二酰輔酶A和甲氧基丙二酰輔酶A合成途徑分別過(guò)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)他克莫司從46.9 mg/L分別提高到95.7和61.3 mg/L，分別提高了100%和30%。在同一株菌株過(guò)表達(dá)兩個(gè)途徑后產(chǎn)量提高到105.9 mg/L，提高了接近125%。

4.2 系統(tǒng)生物學(xué)指導(dǎo)下的他克莫司目標(biāo)基因改造

由于他克莫司前體較多，通過(guò)多條途徑合成，主要涉及到糖代謝、氨基酸代謝和脂肪代謝，受到細(xì)胞內(nèi)還原力、能量供應(yīng)的制約，而且涉及到胞內(nèi)調(diào)控基因的時(shí)序性表達(dá)，而單純的基因工程操作存在不確定性高、且通常只考慮單一的代謝途徑，包含整個(gè)細(xì)胞內(nèi)所有的基因-蛋白-反應(yīng)關(guān)系也只是從化學(xué)計(jì)量角度分析，不能體現(xiàn)細(xì)胞基因所有調(diào)控功能以及反映出的真實(shí)動(dòng)態(tài)胞內(nèi)代謝特性和生物性狀，對(duì)于實(shí)現(xiàn)微生物生理代謝功能的理性全局性調(diào)控水平很有限，很難找到目標(biāo)基因以及更深層次的目標(biāo)酶/酶系研究，因此開(kāi)展他克莫司產(chǎn)生菌基因組尺度動(dòng)態(tài)代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析進(jìn)而改造目的基因、目標(biāo)酶/酶系顯得尤為重要。

隨著基因組測(cè)序?yàn)榇淼拇笠?guī)模數(shù)據(jù)產(chǎn)出，傳統(tǒng)的生物學(xué)研究方式正在發(fā)生改變，在基因組測(cè)序和注釋海量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，基因組尺度穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)重構(gòu)迅速發(fā)展起來(lái)［21］?；蚪M尺度穩(wěn)態(tài)代謝網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)成為研究微生物代謝系統(tǒng)不可缺少的工具［22-23］，在設(shè)計(jì)代謝工程經(jīng)典途徑、代謝物合成、代謝通量分析、不同物種代謝途徑之間的進(jìn)化分析、挖掘組學(xué)數(shù)據(jù)信息以及選擇酶工程靶標(biāo)物方面都具有重要的應(yīng)用［24］。 本課題組［25］對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物他克莫司采用了基于基因組尺度擬穩(wěn)態(tài)的代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并通過(guò)穩(wěn)態(tài)代謝通量分析，OptKnock敲除模擬準(zhǔn)確預(yù)測(cè)出能提高菌株他克莫司產(chǎn)量的目標(biāo)基因，確定對(duì)他克莫司生物合成重要的關(guān)鍵酶;通過(guò)分子改造實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了模型預(yù)測(cè)，構(gòu)建代謝工程菌株產(chǎn)量由150 mg/L提高到450 mg/L。

5 結(jié)語(yǔ)

目前，對(duì)他克莫司的生物合成研究正在朝著多尺度、系統(tǒng)化、合成生物學(xué)的方向發(fā)展。對(duì)模式微生物(如天藍(lán)色鏈霉菌)的代謝網(wǎng)絡(luò)、基因調(diào)控的深入研究，為研究筑波鏈霉菌提高他克莫司產(chǎn)量提供了借鑒意義;隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，動(dòng)態(tài)分析他克莫司的合成及調(diào)控途徑，使菌株合成基因能適時(shí)表達(dá)成為可能。

1)對(duì)他克莫司生產(chǎn)菌的研究應(yīng)采用系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)手段，以整個(gè)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)作為優(yōu)化目標(biāo)，利用轉(zhuǎn)錄組、蛋白組以及代謝組分析，在基因組規(guī)模上做動(dòng)態(tài)分析菌體合成能力將對(duì)遺傳調(diào)控信號(hào)和環(huán)境擾動(dòng)的響應(yīng)，將有利于揭示菌體的遺傳機(jī)理，也將深入理解他克莫司生物合成的調(diào)控機(jī)制，如:轉(zhuǎn)錄調(diào)控、翻譯調(diào)控、反饋抑制和代謝流的分布，實(shí)現(xiàn)在菌體細(xì)胞內(nèi)調(diào)控元件之間的優(yōu)化磨合對(duì)接，極大地提升模型預(yù)測(cè)的能動(dòng)性和精確度，篩選出關(guān)鍵限速節(jié)點(diǎn)，為已有的他克莫司產(chǎn)生菌進(jìn)一步進(jìn)行代謝工程改造提供指導(dǎo)。

2)對(duì)他克莫司關(guān)鍵基因的合成生物學(xué)研究為開(kāi)發(fā)具有更優(yōu)性質(zhì)的合成基因指明了方向。合成生物學(xué)倡導(dǎo)將不同的代謝途徑組成“模塊”，各“模塊”之間按照統(tǒng)一的“接口”進(jìn)行連接并表達(dá)相應(yīng)的新途徑。他克莫司合成機(jī)制的闡明及基因組序列的公布，為合成高效前體途徑關(guān)鍵酶提供了新的有效突破口，從而理性重構(gòu)合成途徑，使菌株最高效地合成目的產(chǎn)物。隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，采用全新酶的模擬優(yōu)化對(duì)接進(jìn)行全新設(shè)計(jì)、改造及優(yōu)化，在不久的將來(lái)，可以根據(jù)目的不同構(gòu)建全新高效的關(guān)鍵酶。

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