張 嫻

同濟大學環(huán)境科學與工程國家實驗教學示范中心 上海 200092

在我們生活的環(huán)境中，微生物無處不在。它們個體極其微小，用肉眼難以觀察，種類繁多，數(shù)量巨大，在人們生活中發(fā)揮著重要的作用。微生物可以用于生產(chǎn)抗生素，治療疾??；也可用于發(fā)酵面包、乳酪等食品；還可以用于城市污水處理廠污水的生物處理等。基于微生物的重要作用，有必要對微生物教學與科研進行深入研究，探索其未知規(guī)律，以便于人們能夠更好地對其加以應用。

通常情況下，微生物是以群體的方式“雜居”在環(huán)境中。為了方便進行研究與應用，一般需要先把目標微生物從微生物群體中分離出來，進行純化，得到其純種。在環(huán)境微生物學實驗課程中，細菌的純種分離與培養(yǎng)實驗，其目的是教會學生將細菌從微生物群體中分離純化出來，最終得到細菌純種[1,2]。

1 細菌純種分離方法

在微生物實驗中，一般通過單菌落分離的方法獲得細菌純種。所謂單菌落分離，就是讓微生物群體在培養(yǎng)基上生長，形成單菌落，然后將目標細菌的單菌落純化，最終得到目標細菌純種。由于分離專性厭氧細菌需要專門的厭氧操作箱或者其他類似的儀器設備，其數(shù)量有限，短時間內(nèi)無法滿足實驗課的需求。因此，在環(huán)境專業(yè)本科生的實驗課中，通常學生分離的是好氧細菌或兼性好氧細菌。針對這兩大類細菌，可以通過平板劃線法、平板表面涂布法或澆注平板法獲得細菌單菌落。

2 實驗材料

細菌的純種分離實驗以環(huán)境樣品作為實驗材料，這些環(huán)境樣品包括從上海曲陽污水處理廠二沉池取來的剩余活性污泥、崇明島灘涂的土壤以及校園河水等。污水處理廠生化反應池中利用微生物組成的活性污泥具有處理污水的功能，而從崇明島采集的土壤樣品和從校園采集的河水水樣都具有一定的代表意義。以這些環(huán)境樣品作為實驗材料，對其進行細菌純種的分離、純化，將實驗教學與環(huán)境問題有機結合，有助于加深環(huán)境專業(yè)本科生對污水生物處理及土壤、河水微生物的認識與理解，拓寬學生的專業(yè)視野，激發(fā)學生的好奇心，促進學生創(chuàng)新思維的培養(yǎng)[2]。

3 細菌的純種分離與培養(yǎng)實驗

平板劃線法、平板表面涂布法和澆注平板法都是以培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)微生物的容器，將適于微生物生長的培養(yǎng)基滅菌、倒平板、冷卻凝固后，通過將樣品在培養(yǎng)基上劃線、涂布樣品稀釋液或者直接將樣品稀釋液和培養(yǎng)基混合均勻的方式，使樣品中微生物的濃度得到稀釋，然后在培養(yǎng)基上生長形成單菌落。雖然這3種實驗方法的具體操作有所不同，但是其本質(zhì)都是將樣品進行稀釋，使樣品中的細菌最終在培養(yǎng)基上形成單菌落，從而得到純菌。本實驗主要學習用澆注平板法分離純化剩余活性污泥中的細菌[3]。

3.1 實驗準備工作

實驗開始以前，需要做好實驗準備工作。由于實驗中學生需要用培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基并稀釋環(huán)境樣品，所以準備工作中最重要的是培養(yǎng)皿以及稀釋環(huán)境樣品所用的物品的準備，此外還有培養(yǎng)基的配制。

根據(jù)實驗需要，每組學生準備若干套培養(yǎng)皿。每套培養(yǎng)皿包括一個培養(yǎng)皿蓋和一個培養(yǎng)皿底，這些培養(yǎng)皿都是事先清洗干凈并在室溫自然晾干的。學生將若干套培養(yǎng)皿按一定的排列順序放入專門的培養(yǎng)皿罐中，然后放入電熱干燥箱中，160 ℃干熱滅菌2小時后取出，放在室溫下冷卻待用。此外，還需要準備1 mL和10 mL的移液管，放入專門的移液管筒中，和培養(yǎng)皿罐一樣進行干熱滅菌。

由于剩余活性污泥需要被梯度稀釋到10-4和10-5濃度，然后再作為實驗材料進行細菌分離，所以學生需要先準備一定量的無菌水，以用于活性污泥的梯度稀釋。準備無菌水時，需要1個錐形瓶和4支同樣大小的試管，錐形瓶中提前加入一些玻璃珠，學生用量筒分別量取90 mL和9 mL的蒸餾水倒入錐形瓶和試管中，塞好棉花塞，包好包裝紙，送入高壓蒸汽滅菌器121 ℃，0.103 MPa滅菌20 min[4]。

3.2 細菌分離純化

進行細菌分離純化時，學生要點燃煤氣燈，在火焰旁進行實驗操作，盡量達到無菌要求。在取來剩余活性污泥樣品后，要首先對其進行梯度稀釋。學生用移液管量取10 mL活性污泥樣品，將其加入錐形瓶90 mL的無菌水中，塞好棉花塞，搖晃錐形瓶，通過玻璃珠的作用將活性污泥打碎，形成濃度為10-1的均勻混合液，然后用移液管量取濃度為10-1的1 mL混合液，加入到試管9 mL的無菌水中，形成濃度為10-2的混合液，按照相同的方法依次稀釋，最終將活性污泥稀釋到10-4和10-5濃度，最后用移液管分別取1 mL活性污泥稀釋液加入到空的培養(yǎng)皿中，在培養(yǎng)皿蓋上寫上編號。

在準備好實驗樣品以后，學生在小鐵鍋內(nèi)放入自來水，將已經(jīng)滅菌并冷卻凝固的培養(yǎng)基放進鐵鍋中，水浴加熱，等培養(yǎng)基完全融化以后，將其放到實驗臺上，室溫冷卻，等到學生用手觸摸盛培養(yǎng)基的錐形瓶不燙手時，就可以倒平板。此時，培養(yǎng)皿中已經(jīng)分別加入了濃度為10-4和10-5的活性污泥樣品，學生左手拿培養(yǎng)皿，用大拇指和食指略微打開培養(yǎng)皿的蓋，其余3個手指托住培養(yǎng)皿的底，同時右手拿培養(yǎng)基，在培養(yǎng)皿內(nèi)倒入少量培養(yǎng)基，使培養(yǎng)基能鋪滿培養(yǎng)皿底即可，然后將培養(yǎng)皿放在實驗臺上，輕輕來回轉動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和活性污泥樣品充分混合均勻。待培養(yǎng)基徹底冷卻、凝固成平板以后，將其倒置放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24～48小時，就能在平板上觀察到若干圓形、顏色均勻、邊緣清晰的細菌單菌落。

4 實驗效果

通過實驗，學生學會使用澆注平板法分離純化剩余活性污泥中的細菌。實驗需要準備培養(yǎng)皿、無菌水、移液管和培養(yǎng)基等物品，并涉及干熱、濕熱滅菌，鍛煉了學生的動手操作能力。在實驗過程中，需要先稀釋實驗樣品、將樣品加入培養(yǎng)皿，然后加熱融化培養(yǎng)基、倒平板。整個實驗過程需要無菌操作，并且操作要求的注意事項比較多，需要各組學生互相配合，充分溝通，共同努力，才能順利完成實驗。絕大多數(shù)小組的學生觀察到了細菌的單菌落，本實驗獲得了非常好的教學效果[5,6]。

[1] 洪慶華,徐正,秦璐璐.環(huán)境微生物學實驗教學的改革[J].實驗室研究與探索,2011,30(5):101-103.

[2] 鄧百萬,陳文強,彭浩.基于能力培養(yǎng)的微生物實驗教學手段與方法的改革研究[J].實驗技術與管理,2011,28(2):7-10.

[3] 周群英,王士芬.環(huán)境工程微生物學[M].第三版.北京:高等教育出版社,2008.

[4] 王云創(chuàng),秦丹,劉俊杰.在實驗教學中培養(yǎng)創(chuàng)造性思維能力[J].實驗室研究與探索,2010,29(5):140-142.

[5] 梁璐怡,胡寶蘭,朱亮.環(huán)境微生物學實驗教學改革[J].實驗技術與管理,2012,29(9):126-128,131.

[6] 羅志勇,張勝濤,周曉梅.高校學生創(chuàng)新實踐能力培養(yǎng)的探索與思考[J].實驗技術與管理,2009,26(7):28-30.