周 珂左和寧陳北陽蔡光先

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙，410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410007；3湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙，410006）

加味黑地黃湯超微飲片對UUO大鼠腎臟纖維化的影響

周 珂1左和寧1陳北陽2蔡光先3

（1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙，410007；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙，410007；3湖南省中醫(yī)藥研究院，長沙，410006）

目的：觀察加味黑地黃湯超微飲片對單側(cè)輸尿管結(jié)扎（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）大鼠腎臟纖維化的影響。方法：采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法復(fù)制單側(cè)輸尿管梗阻致大鼠腎間質(zhì)纖維化模型，將其隨機(jī)均分為空白組、假手術(shù)組、模型對照組、超微飲片組、尿毒清顆粒組，每組10只。加味黑地黃湯超微飲片組和尿毒清顆粒劑組分別予加味黑地黃湯超微飲片和尿毒清顆粒劑溶于4 m L蒸餾水灌胃，空白組、假手術(shù)組和模型組均予等體積蒸餾水灌胃。在UUO術(shù)后第14 d，將各組大鼠處死，分別取腎組織以TUNEL法檢測各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡，并檢測各組大鼠血液流變學(xué)，以及血肌酐和尿素氮。結(jié)果：經(jīng)過TUNEL法檢測，超微組和尿毒清顆粒組對于腎間質(zhì)纖維化大鼠的腎組織細(xì)胞的凋亡均有改善作用（P＜0.01），且2者作用相近（P＞0.05）；尿毒清顆粒劑對UUO大鼠血液流變學(xué)的改善優(yōu)于超微飲片組（P＜0.05）；而超微飲片組和尿毒清顆粒劑組血肌酐和尿素氮均下降，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。結(jié)論：加味黑地黃湯超微飲片能改善UUO大鼠腎組織的細(xì)胞凋亡和血液流變學(xué)指標(biāo)，改善腎組織的纖維化。

黑地黃湯；超微飲片；UUO；纖維化

腎間質(zhì)纖維化（Renal Interstitial Fibrosis，RIF）是所有慢性腎臟疾病進(jìn)展至終末期腎病的共同通路［1］。細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular Matrix，ECM）和細(xì)胞凋亡對RIF的形成具有重要作用。高燕等通過實(shí)驗(yàn)證明［2］，大量腎小管細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腎小管局部環(huán)境破壞，可能是觸發(fā)間質(zhì)細(xì)胞過度增殖，并最終形成纖維化的重要因素。本研究采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎（Unilateral Ureteral Obstruction，UUO）大鼠模型，通過觀察加味黑地黃湯超微飲片對腎臟細(xì)胞凋亡的影響，闡明其對腎臟纖維化的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 體質(zhì)量為（200±20）g的清潔級健康SD雄性大鼠50只，大鼠飼養(yǎng)環(huán)境保持通風(fēng)、恒溫、安靜，定期更換墊料，消毒籠具。給予12 h燈光照射管制。

1.1.2 藥物 加味黑地黃湯超微飲片（批號：Y20120124，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科提供）。藥物組成：熟地黃10 g，白花蛇舌草15 g，白術(shù)10 g，生地黃10 g，山茱萸10 g，砂仁6 g，五味子6 g，蟬蛻5 g。尿毒清顆粒劑（國藥準(zhǔn)字Z20073256，由廣州康臣制藥有限公司提供）。

1.1.3 試劑及儀器 大鼠細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒：武漢博士德生物工程有限公司（MK1020）；免疫組化SP試劑盒及DAB試劑盒：博士德公司產(chǎn)品。LBYN6血液流變儀：北京普利生儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 分組、造模及給藥 依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的方法［3］進(jìn)行造模。以10%水合氯醛麻醉大鼠（0.35 mL/100 g），然后將大鼠俯臥固定于大鼠固定板上，定位于左側(cè)背部，剪毛并用絡(luò)合碘消毒，從脊柱向左側(cè)旁開約1 cm、肋下約1 cm處向尾部方向切開皮膚，約1～2 cm開口，鋪無菌紗布，鈍性分離皮下組織及肌層，暴露左側(cè)腎臟，沿腎蒂向腎下極方向?qū)ふ易筝斈蚬?，于中?/3雙4號線結(jié)扎，從結(jié)扎線之間離斷輸尿管，使左輸尿管完全梗阻，后逐層縫合。假手術(shù)組僅切開腹腔并游離左側(cè)輸尿管，但不結(jié)扎和剪斷。將體質(zhì)量為（200±20）g的清潔級健康SD雄性大鼠50只隨機(jī)分為空白組、假手術(shù)組、模型組、超微組、尿毒清組，每組10只。其中超微組按“人的劑量×0.018×5/kg體重”計(jì)算，將加味黑地黃湯超微飲片溶于4 mL蒸餾水后灌胃，尿毒清顆粒劑組（10 mg·kg-1·d-1）將尿毒清顆粒劑溶于等體積蒸餾水后灌胃，正常組、假手術(shù)組、模型組均予等體積蒸餾水灌胃，直到處死為止。術(shù)后第2 d開始灌胃，2次/d，上午8—9點(diǎn)、下午3—4點(diǎn)各1次。

1.2.2 檢測指標(biāo)及方法 在UUO術(shù)后第14 d以10%水合氯醛0.3 mL/100 g腹腔注射麻醉大鼠，各組大鼠分別以斷頸取血法用試管取血約3 mL，以2 000 r/min，離心5 min后得到血清，分離血清取1 m L放入EP管中，放入-70℃冰箱中保存。采用苦味酸法檢測血肌酐（Serum Creatinine，Scr）；采用脲酶-波氏比色法檢測血尿素氮（Blood Urea Nitrogen，BUN）；采用雙縮脲法檢測24 h尿蛋白。由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院生化檢驗(yàn)室測定。應(yīng)用TUNEL方法查各組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況，以腎間質(zhì)棕褐色染色區(qū)為陽性目標(biāo)區(qū)。用彩色多媒體病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析后，計(jì)算每個(gè)視野凋亡陽性細(xì)胞總個(gè)數(shù)占統(tǒng)計(jì)場總面積的百分比。運(yùn)用LBY-N6血液流變儀檢測大鼠全血高切黏度（High Shear Blood Viscosity，Hηb）、低切黏度（Low Shear Blood Viscosity，Lηb）、血漿黏度（Plasma Viscosity，ηp）、紅細(xì)胞壓積（Hematocrit，Hct）。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎功能的變化比較 見表1。超微組和尿毒清組大鼠血肌酐和尿素氮均明顯低于模型組（P＜0.01或P＜0.05），而超微組和尿毒清組之間對血肌酐的改善無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），超微組對尿素氮的改善優(yōu)于尿毒清組（P＜0.05）。

表1 灌胃后各組大鼠血肌酐、尿素氮比較（±s）

表1 灌胃后各組大鼠血肌酐、尿素氮比較（±s）

注：Scr比較：**P＜0.01，各組與模型組比較；△P＞0.05，空白組與假手術(shù)組比較，超微組與尿毒清組比較。BUN比較：**P＜0.01，空白組、假手術(shù)組和超微組與模型組比較；*P＜0.05，尿毒清組與模型組比較；▲P＜0.05，超微組與尿毒清組比較。

組別例數(shù)SCr（μmoL/L）BUN（mmoL/L）空白組10 56.34±7.81**5.36±0.40**假手術(shù)組10 58.25±9.24**△5.71±0.32**△模型組10 109.18±10.50 9.62±1.04超微組10 86.82±12.41**6.11±0.36**尿毒清組10 87.18±11.47**△7.46±0.83*▲

2.2 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡面密度比較 見表2。用彩色多媒體病理圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析后，計(jì)算每個(gè)視野凋亡陽性細(xì)胞總個(gè)數(shù)占統(tǒng)計(jì)場總面積的百分比。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)各組與模型組相比，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而空白組和假手術(shù)組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），超微組和尿毒清組之間亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的病理圖片見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡的病理圖

表2 灌胃后各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡面密度比較（±s）

表2 灌胃后各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡面密度比較（±s）

注：*P＜0.05，各組與模型組組對比；△P＞0.05，超微組與尿毒清組對比；△P＞0.05，空白組與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

組別例數(shù)凋亡面密度空白組10 0.64±0.50*假手術(shù)組10 0.69±0.24*△模型對照組10 7.47±2.74超微飲片組10 2.50±1.30*△尿毒清顆粒組10 2.46±1.69*

2.3 各組大鼠血液流變學(xué)檢測結(jié)果 見表3。超微組和尿毒清組大鼠血Hηb、Lηb、ηp、Hct均明顯低于模型組（P＜0.01），而超微組和尿毒清組之間對Hηb的改善無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），尿毒清組對Lηb、ηp、Hct的改善優(yōu)于超微組大鼠（P＜0.05）。

3 討論

RIF是指由多種原因引起的ECM成分在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積，導(dǎo)致了腎小球正常結(jié)構(gòu)消失，腎單位毀損，腎小管變性萎縮、間質(zhì)細(xì)胞增殖等［4］，是各種慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)。研究表明，ECM和細(xì)胞凋亡對RIF的形成具有重要作用。既往研究表明［5-7］，細(xì)胞凋亡參與了腎小管損傷及間質(zhì)纖維化進(jìn)程，使腎小管上皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯增多，纖維化逐漸加重，并與腎功能惡化密切相關(guān)，而改善細(xì)胞凋亡可以改善腎臟纖維化。在對腎臟纖維化的治療過程中，中藥復(fù)方以多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)發(fā)揮作用為特點(diǎn)表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢［8-9］。何立群教授通過多年臨床實(shí)踐，認(rèn)為腎臟纖維化病因病機(jī)是本虛標(biāo)實(shí)，脾腎虧虛為本，瘀血、濕濁、濕熱、毒邪、風(fēng)邪為標(biāo)，其益氣溫陽、活血化瘀的治法在臨床實(shí)踐中取得了較好療效［10］。血凝狀態(tài)和血液流變學(xué)的改變在腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中也產(chǎn)生重要影響，RIF的形成與流經(jīng)腎臟的血黏度增高有著直接關(guān)系，呂小燕等［11］通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)，RIF大鼠血液流變學(xué)指數(shù)是升高的，予以“活血通絡(luò)”的大黃蟲丸可以改善其纖維化程度。因此，對腎臟細(xì)胞凋亡和血液流變學(xué)的改善在RIF的治療中有著重要意義。

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響（±s）

表3 各組大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響（±s）

注：**P＜0.01，各組與模型組比較；△P＜0.05，▲P＞0.05，超微組和尿毒清組與模型組比較。

組別例數(shù)Hηb（mpa·s）Lηb（mpa·s）ηp（mpa·s）Hct（%）空白組10 3.10±0.11**8.31±0.40**1.22±0.14**49.16±2.24**假手術(shù)組10 3.42±0.09**9.33±0.51**1.28±0.10**50.73±2.02**模型對照組10 5.02±0.14 13.06±0.89 1.97±0.17 69.33±2.15超微飲片組10 3.87±0.15**▲10.31±0.37**△1.53±0.12**△57.81±2.47**△尿毒清顆粒組10 3.76±0.17**9.45±0.51**1.36±0.09**54.26±1.94**

圖2 細(xì)胞凋亡（TUNEL法）

UUO大鼠是RIF病變非常成功的動(dòng)物模型，其腎損傷特征類似于人類進(jìn)行性RIF［12］。因此我們采用大鼠UUO模型作為觀察對象來探索藥物對RIF的治療機(jī)制。隨著中醫(yī)藥臨床價(jià)值的提高，廣大人民群眾亟需服用方便、切實(shí)有效的中藥。中藥配方超微飲片是湖南省中醫(yī)藥研究院采用現(xiàn)代高新技術(shù)與傳統(tǒng)炮制技術(shù)相結(jié)合的新型納米級中藥飲片，將每一種中藥飲片分別制成單味制劑，醫(yī)生辨證施治處方中藥中的單味制劑，經(jīng)司藥人員調(diào)配，患者可以直接以開水沖泡服用。研究發(fā)現(xiàn)［13］，超微飲片對原有藥材的藥效學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)予以了保留，且有效成分溶出量得到顯著增加。本研究應(yīng)用加味黑地黃湯以超微飲片形式給UUO大鼠灌胃，發(fā)現(xiàn)通過對細(xì)胞凋亡和血液流變學(xué)的改善作用對腎功能有明顯改善作用，從而對其纖維化程度能有明顯改善。其中，熟地黃、白花蛇舌草共為君藥，體現(xiàn)了補(bǔ)腎泄?jié)嶂?。白術(shù)、生地黃、山茱萸補(bǔ)脾益腎澀精，同為臣藥。五味子收斂固澀，益氣生津，補(bǔ)腎寧心；砂仁行氣止痛、溫胃止嘔；蟬蛻散風(fēng)除熱共為佐藥。這些藥物組合可脾腎兼顧，補(bǔ)瀉兼施，具有扶正排毒之功，可明確改善腎功能，改善腎組織細(xì)胞凋亡、降低血液黏度的作用，對于防治腎臟纖維化不失為一較好選擇。筆者曾以相同組方的院內(nèi)制劑干預(yù)UUO大鼠，發(fā)現(xiàn)其對UUO大鼠的Scr、BUN、尿蛋白定量及FN、ColⅣ都有明確改善作用［14］。還有研究表明［15］，在同樣使用麻黃湯時(shí)，超微飲片與常規(guī)飲片藥效學(xué)最低起效劑量為傳統(tǒng)飲片起效劑量的1/2～1/4倍?？梢姡兴幊嬈哂兴幉墓?jié)省、費(fèi)用減少、質(zhì)量可控、方便衛(wèi)生等優(yōu)點(diǎn)。另外，筆者認(rèn)為超微制劑便于攜帶服用，療效肯定，配方靈活的特性必定會使患者更易于接受，也更有利于中醫(yī)藥的推廣應(yīng)用。

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（2013-10-17收稿 責(zé)任編輯：徐穎）

Effects of M icro Decoction Pieces of M od ified Heidihuang Decoction on Renal Fibrosis in UUO Rats

Zhou Ke1，Zuo Hening1，Chen Beiyang2，Cai Guangxian3
（1 First Affiliated Hospital of Hunan Traditional Medicine University，Changsha 410007，China；2 Hunan Traditional Chinese Medical University，Changsha 410007，China；3 Institute of Hunan Traditional Medicine，Changsha 410006，China）

Objective：To observe the effectofmicro decoction pieces ofmodified Heidihuang decoction on renal fibrosis rats caused by unilateral ureteral obstruction（UUO）.Methods：Rat fibrosismodelswere established through unilateralureteralobstruction，then those rats were random ly divided into blank group，sham group，model control group，micro decoction pieces group，Niaoduqing group，with 10 in each group.Themicro decoction pieces ofmodified Heidihuang decoction and Niaoduqing granules dissolved in 4m l distilled water were respectively administered intragastrically to rats in micro decoction pieces group and Niaoduqing group.Rats in the blank group，control group andmodelgroup were allgave intra-gastric administration with the same volume of distilled water.14 daysafter UUO，kidney tissues of rats in each group were taken with TUNELmethod to detect kidney tissue apoptosis.At the same time，Hemorheology and serum creatinine and urea nitrogen of each group ratwere detected.Results：By TUNELmethod，the renal tissue cell apoptosis ofmicro decoction pieces group and Niaoduqing group with renal interstitial fibrosis ratswere improvedmore better thanmodel group（P＜0.01），but there was no significant difference（P＞0.05）.The hemorheology of Niaoduqing group improvementwas better than that ofmicro decoction pieces group（P＜0.05）；the serum creatinine and urea nitrogen ofm icro decoction pieces group and Niaoduqing group with renal interstitial fibrosis ratswere improved better than that of themodel group（P＜0.01 or P＜0.05）.Conclusion：Micro decoction pieces ofmodified Heidihuang decoction can relieve renal interstitial fibrosis caused by UUO in rats by improving hemorheology indexes and renal tissue cell apoptosis.

Heidihuang decoction；Micro decoction pieces；UUO；Fibrosis

R242；R256.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.09.031

蔡光先（1951.7—），男，醫(yī)學(xué)碩士，研究員，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對內(nèi)科疾病的防治機(jī)制的研究，E-mail：doctor168899＠163.com