王春明，郭建國，漆永紅，呂和平，杜蕙，劉長遠(yuǎn)

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州730070；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，遼寧沈陽 110161）

葡萄內(nèi)生細(xì)菌菌株Zyx-3生理生化特性及抑菌能力測定

王春明1，郭建國1，漆永紅1，呂和平1，杜蕙1，劉長遠(yuǎn)2

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州730070；2.遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，遼寧沈陽 110161）

以分離自葡萄葉片內(nèi)生細(xì)菌菌株Zyx-3為研究對(duì)象，依據(jù)其形態(tài)特征、生理生化特性等初步確定了其分類地位，并采用平板對(duì)峙法測定了其對(duì)14種植物病原真菌的抑菌能力。結(jié)果表明，Zyx-3菌體桿狀，中生芽孢，革蘭氏染色陽性；菌株具有運(yùn)動(dòng)性和需氧性，可以使明膠液化、淀粉水解，接觸酶反應(yīng)陽性，具有耐鹽性，可在10%NaCl培養(yǎng)液中生長。根據(jù)其形態(tài)特征及生理生化特性，初步確定其為芽孢桿菌（Bacillus spp.）。該菌株對(duì)玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoefonia solani）、半夏早疫病菌（Alternaria sonali）、蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）和葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）等14種供試植物病原真菌均有不同程度的抑制作用，抑菌譜廣。

內(nèi)生細(xì)菌；形態(tài)特征；生理生化特性；拮抗作用

目前，化學(xué)農(nóng)藥的使用對(duì)農(nóng)作物病蟲害的防治起到了重要作用。但是，長期大量使用化學(xué)農(nóng)藥，不僅對(duì)土壤、大氣和水體等環(huán)境造成嚴(yán)重污染，對(duì)人、畜健康造成危害，還導(dǎo)致病蟲抗藥性上升，防治效果逐步降低，防治難度增加，而利用微生物進(jìn)行病蟲害的防治和農(nóng)藥殘留的清除是一種無公害、無二次污染的高新技術(shù)，是微生物學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)［1～3］。

植物體是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)，幾乎所有健康植物體內(nèi)均含有內(nèi)生細(xì)菌。這些內(nèi)生細(xì)菌不僅將植物作為其棲息場所，而且對(duì)寄主植物有促生、防病、內(nèi)生固氮等多方面的生物學(xué)作用。同時(shí)，植物內(nèi)生細(xì)菌還是良好的外源基因載體，為抗病殺蟲及固氮等植物外源基因向植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移提供了一種新的方法和途徑。許多學(xué)者認(rèn)為，內(nèi)生細(xì)菌是植物病害生物防治的天然資源菌，具有廣闊的理論研究價(jià)值和開發(fā)應(yīng)用前景［4］。中國具有豐富的微生物資源，其中存在大量可開發(fā)利用的優(yōu)良菌株，但由于植物內(nèi)生細(xì)菌定殖于植物內(nèi)部的細(xì)胞間隙中，且同一植株不同部位內(nèi)生細(xì)菌的種類和功效也可能不同，因而給內(nèi)生細(xì)菌的研究帶來一定的困難。許多學(xué)者已從棉花、玉米、小麥、油菜、馬鈴薯、辣椒等多種植物體中分離獲得內(nèi)生拮抗細(xì)菌，這些內(nèi)生拮抗細(xì)菌對(duì)多種植物病害具有較好的防治效果，合理利用可以減輕化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染，有利于保持生態(tài)平衡［5～9］。目前，對(duì)果樹內(nèi)生細(xì)菌的分離、篩選及其分類鑒定地位的研究較少。我們對(duì)葡萄葉片內(nèi)生微生物區(qū)系中分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌菌株Zyx-3的抑菌能力、形態(tài)、生理生化特性等進(jìn)行了研究，初步確定其分類地位，以期為開發(fā)經(jīng)濟(jì)環(huán)保的生物農(nóng)藥提供菌種資源，為果樹植物內(nèi)生拮抗菌的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試內(nèi)生細(xì)菌菌株Zyx-3于2012年9月分離自葡萄品種醉人香葉片。指示植物病原真菌名稱及編號(hào)見表1，均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所植物病害研究室提供。

表1 供試植物病原真菌

1.2 方法

1.2.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察將內(nèi)生細(xì)菌菌株Zyx-3在PDA平板上培養(yǎng)24 h，用顯微鏡觀察其菌體形態(tài)和芽孢等重要特征，利用革蘭氏染色等方法進(jìn)行鑒定。

1.2.2 培養(yǎng)特性觀察取菌齡24～48 h的Zyx-3菌株，分別接種在PDA（去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂12 g，自來水1 000 mL，自然pH）平板、PDA斜面、NA培養(yǎng)液（牛肉膏3 g，酵母浸膏1 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，瓊脂12 g，自來水1 000 mL，pH 7.2）中，28 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察其生長特性。

1.2.3 生理生化特性測定參照方中達(dá)《植物病理研究方法》和喬宏萍等的研究方法［10］，對(duì)Zyx-3菌株進(jìn)行需氧性和運(yùn)動(dòng)性、明膠液化、淀粉水解、檸檬酸鹽利用，以及纖維素水解、甲基紅試驗(yàn)、H2S產(chǎn)生、接觸酶和耐鹽性測定。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3抗真菌譜的測定將表1中的14種植物病原真菌作為指示菌，在培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中倒入15 mL PDA培養(yǎng)基，取指示菌菌落邊緣的菌絲塊（直徑5 mm）放在倒好的PDA平板中央，在培養(yǎng)皿背面距指示菌25 mm標(biāo)記4點(diǎn)，分別在這4點(diǎn)點(diǎn)接在NA培養(yǎng)基上經(jīng)活化培養(yǎng)48 h的內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3菌株，以不點(diǎn)接內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3菌株為對(duì)照，置于28 ℃下培養(yǎng)，每處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)5 d后觀察Zyx-3菌株在平板上的抑菌現(xiàn)象，測量抑菌帶的寬度（即內(nèi)生細(xì)菌落邊緣到供試病原真菌菌落邊緣的距離）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài)特征

經(jīng)過革蘭氏染色、顯微鏡觀察可見，內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3菌體呈桿狀，革蘭氏染色為陽性，芽孢著生于菌體的中間，呈柱形或者橢圓形（圖1）。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3的形態(tài)

2.2 菌株培養(yǎng)特性

內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3在PDA平板上生長的菌落呈圓形，表面凸起，后產(chǎn)生皺褶，表面無光澤，不光滑。在PDA斜面上劃線培養(yǎng)生長良好，邊緣整齊，無光澤。在澄清的NA培養(yǎng)液中生長良好，在培養(yǎng)液表面形成褶皺的膜層，生長物聚在膜下，液體不渾濁。

2.3 生理生化測定結(jié)果

對(duì)內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3進(jìn)行生理生化測定的結(jié)果表明，菌株需氧性和運(yùn)動(dòng)性呈現(xiàn)陽性；可以使明膠液化；水解淀粉周圍不變色，為陽性反應(yīng)；不能利用檸檬酸鹽；不能水解纖維素；不產(chǎn)生H2S；過氧化氫酶反應(yīng)為陽性；具有耐鹽性，可以在10% NaCl培養(yǎng)液中生長；甲基紅試驗(yàn)結(jié)果顏色為黃色，呈陰性反應(yīng)。

2.4 抑菌能力

由對(duì)峙培養(yǎng)5 d的結(jié)果（圖2）可見，內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3具有較廣的抗真菌譜，14種供試病原真菌的生長不同程度地受到菌株Zyx-3的抑制，抑菌帶在4.2～11.5 mm。其中Zyx-3對(duì)玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和半夏早疫病菌（Alternaria sonali）的抑制效果最強(qiáng)，抑菌帶分別達(dá)11.5 mm和11.1 mm；對(duì)馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoefonia solani）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抑制效果較強(qiáng)，抑菌帶寬度在8 mm以上；對(duì)番瓜綿腐病菌（Pythiun aphanidermatua）的抑制效果最弱，但抑菌帶也在4 mm以上。且在28 ℃條件下黑暗培養(yǎng)，蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、西瓜蔓枯病菌（Mycosphaerellam elonis）、馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoefonia solani）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）培養(yǎng)5 d的對(duì)照組已長滿皿，棉花枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp.vesinfectum）和西葫蘆綿腐病菌（Pythiun aphanidermatua）培養(yǎng)6 d的對(duì)照組長滿皿，蘋果輪紋病菌（Physalospora piricola）、辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici Leonian）和黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. Cucumerinum）培養(yǎng)7 d的對(duì)照組長滿皿，玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）、葡萄白腐病菌（Coniothyrium diplodiella）培養(yǎng)8 d的對(duì)照組長滿皿，辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）培養(yǎng)10 d的對(duì)照組長滿皿，而半夏早疫病菌（Alternaria sonali）培養(yǎng)14 d的對(duì)照組未長滿皿。當(dāng)對(duì)照均長滿皿時(shí)，內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3對(duì)14種供試的植物病原真菌抑菌帶仍在4.1～11.0 mm，其中對(duì)玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和半夏早疫病菌（Alternaria sonali）的抑制帶寬度仍保持在9 mm以上。

圖2 對(duì)峙培養(yǎng)5 d后內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3與供試植物病原真菌之間的抑制效果

3 小結(jié)與討論

1）從葡萄葉片中分離到的內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3菌體呈桿狀，革蘭氏染色為陽性，芽孢著生于菌體的中間，呈柱形或者橢圓形，且菌株具有運(yùn)動(dòng)性和需氧性，可以使明膠液化；可以使淀粉水解；過氧化氫酶反應(yīng)陽性，具有耐鹽性，可在10% NaCl培養(yǎng)液中生長。菌體桿狀，中生芽孢，革蘭氏染色陽性。Zyx-3對(duì)14種指示植物病原真菌的生長均具有明顯的抑制作用，其中對(duì)玉米大斑病菌（Exserohilum turcicum）和半夏早疫病菌（Alternaria sonali）的抑制效果最強(qiáng)，對(duì)馬鈴薯立枯絲核病菌（Rhizoefonia solani）、蘋果腐爛病菌（Valsa mali）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、茄子菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）的抑制效果較強(qiáng)。

2）細(xì)菌因龐大的種群、高繁殖力等特點(diǎn)而易于人工培養(yǎng)，在自然發(fā)生的生物防治和人類應(yīng)用生物防治的活動(dòng)中，拮抗細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物都起到了重要作用。目前，應(yīng)用較多的生防細(xì)菌主要有芽孢桿菌（Bacillus spp.）、假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）等［11］。而芽孢桿菌（Bacillus spp.）是目前生防細(xì)菌中研究較多的一類，因其能夠產(chǎn)生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機(jī)溶劑的內(nèi)生孢子，所以是理想的生防菌篩選對(duì)象［12～13］。芽孢桿菌的抑菌范圍也很廣，包括根部病害、枝干病害、葉、花部病害和收獲后果品病害［14］。已報(bào)道的生防芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）、多粘芽孢桿菌（B.polymyxa）、巨大芽孢桿菌（B.megaterium）、短小芽孢桿菌（B.pumilus）等［15］。根據(jù)東秀珠等的《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》描述，初步確定葡萄內(nèi)生細(xì)菌Zyx-3菌株為芽孢桿菌（Bacillus spp.）［16］。該芽孢桿菌具有較廣的抗真菌譜，為葡萄真菌病害和其他真菌病害的生物防治提供了新的微生物資源，是一種具有潛在應(yīng)用前景的生防菌株。但其產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、生防作用是否穩(wěn)定，在田間的定植能力、適應(yīng)性、穩(wěn)定性以及田間防治效果還有待于進(jìn)一步研究。

［1］MARTIN F N.Development of alternative strategies for managing soilborne pathogens currently controlled with methyl bromide［J］.Annu Rev Phytopathol，2003（41）：325-350.

［2］張海英，劉永剛.生物農(nóng)藥在中藥材生產(chǎn)中的應(yīng)用綜述［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，2013（12）：44-48.

［3］楊森，宋高利，董兆麟，等.一株Burkholderia細(xì)菌的抗植物病源真菌及生物學(xué)特性的研究［J］.西北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008，38（5）：779-782.

［4］STURZ A V，CHRISTIE B R，NOWAK J.Baterial endophytes：Potential role in developing sustainable systems of crop production［J］.Critical Reviews in Plant Sciences，2000，19（1）：1-30.

［5］蘭海燕，王長波，宋未.棉花內(nèi)生細(xì)菌及其研究進(jìn)展［J］.棉花學(xué)報(bào)，2000，12（2）：105-108.

［6］袁平，孫福右，田宏先.防治馬鈴薯環(huán)腐病有益內(nèi)生細(xì)菌的分離和篩選［J］.微生物學(xué)報(bào)，2002，2（3）：70-74.

［7］何紅，蔡學(xué)清，洪永聰.辣椒內(nèi)生細(xì)菌的分離及接抗菌的篩選［J］.中國生物防治，2002，18（4）：171-175.

［8］楊海蓮，孫曉璐，宋未.植物內(nèi)生細(xì)菌的研究［J］.微生物學(xué)通報(bào)，1998，25（4）：224-227.

［9］FISHER P J，PERTIN O，SCOTT HML，et al.Research on the plant endophytes［J］.New Phytologist，1992，12（2）：299-305.

［10］方中達(dá).植物病理研究方法［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：205-211.

［11］程亮，游春平，肖愛萍.拮抗細(xì)菌的研究進(jìn)展［J］.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25（5）：732-737.

［12］OBAGWU J，KORSTEN L.Integrated control of citeus green and blue molds using Bacillus subtilis in combination with sodium bicarbonate or hotwater［J］.Postharvest Biology and Technology，2003（28）：187-194.

［13］ELIZABETH A B EMMERT，JO HANDELSMAN.Biocontrol of plant disease:a（Gram-）positive perspective［J］.FEMS Microbiol Letters，1999（171）：1-9.

［14］楊佐忠.枯草桿菌拮抗體在植物病害生物防治中的應(yīng)用［J］.四川林業(yè)科技，2001（9）：41-43.

［15］SHODA M.Bacterial control of plant diseases［J］.Biosci Bioeng，2000，89（6）：515-521.

［16］東秀珠，蔡妙英.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：267-295.

（本文責(zé)編：王建連）

Physiological and Biochemical Characteristics of Endophytic Bacteria Strains of Zyx-3 in Grape Leaves and Its Antibacterial Ability Determination

WANG Chun-ming1，GUO Jian-guo1，QI Yong-hong1，LV He-ping1，DU Hui1，LIU Chang-yuan2
（1. Institute of plant protection，Gansu Academy of Agricultural Sciences，Lanzhou Gansu 730070，China；2. Institute of plant protection，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang Liaoning 110161，China）

The strain Zyx-3 was isolated from grape leaves endophytic bacteria as research object，on the basis of their morphological characteristics，physiological and biochemical characteristics were confirmed its classification status，and the 14 kinds of plant pathogenic fungi inhibitory ability were determined by plate confrontation method.The results shows that the strain Zyx-3 are also rod-shaped，grown in the middle at the end the character of movement quality and aerobic，can make the gelatin liquefaction，starch hydrolysis，contact enzyme reaction is positive，with salt tolerance，can be cultured in the culture medium 10% NaCl.According to its morphological，physiological and biochemical characteristics of cell，initially identified as Bacillus（Bacillus spp.）.For 14 kinds of plant pathogenic fungi tested，their have inhibition of different degree，Broad spectrum antimicrobial which the strain of Exserohilum turcimali，Colletotrichum capsici，Valsa mali，Rhizoefonia solani；Alternaria sonali；Physalospora piricola，Botrytis cinerea and Coniothyrium diplodiella，Sclerotinia sclerotiorum.

Endophytic bacteria；Morphology；Physiological and biochemical characteristics；Antagonism

S182；S663.1

A

1001-1463（2014）10-0007-04

10.3969/j.issn.1001-1463.2014.10.003

2014-06-16

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)資助項(xiàng)目（201203035）、甘肅省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（1204NKCA099）、甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年基金項(xiàng)目（2013GAAS35）部分內(nèi)容

王春明（1979—），女，甘肅武威人，助理研究員，主要從事農(nóng)作物病害研究工作。聯(lián)系電話：（0931）7617133。E-mail：wchm179@163.com

杜蕙（1970—），女，甘肅臨洮人，副研究員，主要從事農(nóng)作物病害研究工作。聯(lián)系電話：（0931）7651179。E-mail:dh0928@163.com