王昌陵，宋書宏，孫旭剛，王文斌

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，沈陽(yáng) 110161）

花粉萌發(fā)是高等植物完成有性生殖的重要環(huán)節(jié)[1]，花粉萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度是衡量花粉生活力的主要標(biāo)志。無(wú)論在大豆常規(guī)育種中進(jìn)行親本的選擇配置，還是開(kāi)展雜交大豆育種試驗(yàn)，都需要研究大豆花粉的萌發(fā)問(wèn)題[2]。

花粉的萌發(fā)是花粉粒吸水后，體積增大，內(nèi)部膨壓增加，使花粉粒內(nèi)壁沿萌發(fā)孔向外突出，形成花粉管的過(guò)程[3]?；ǚ哿５拿劝l(fā)啟動(dòng)是一個(gè)較復(fù)雜的過(guò)程[4]。多種植物花粉的離體萌發(fā)研究表明：花粉離體萌發(fā)的基本條件需要有碳源、礦物質(zhì)元素及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的參與，只有在培養(yǎng)基中含有足量且合適的營(yíng)養(yǎng)組分并在適宜的pH和溫度等條件下，花粉才能正常萌發(fā)生長(zhǎng)[5]。

大豆花粉萌發(fā)能力的差異直接影響有性繁殖能力及育種價(jià)值的評(píng)價(jià)。而前人對(duì)于大豆花粉離體培養(yǎng)的報(bào)道較少，適宜大豆花粉萌發(fā)的培養(yǎng)條件尚需探索。應(yīng)用Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)法篩選了大豆花粉萌發(fā)的主要影響因素[6]，旨在對(duì)大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為大豆雜交育種和親本配置研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 大豆材料

供試大豆材料為遼豆15號(hào)，為遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所選育的北方春大豆品種，2013年種植于遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院（沈陽(yáng)市）試驗(yàn)田內(nèi)。

1.2 花粉采集方法

在7月中上旬R2時(shí)期（盛花期），于發(fā)育正常的植株上選取花蕾，花蕾的大小應(yīng)盡量一致，并符合當(dāng)日可做雜交父本的標(biāo)準(zhǔn)，用鑷子取下后置于干凈離心管內(nèi)放4℃冰箱保存，當(dāng)日使用。

1.3 花粉培養(yǎng)方法

花粉采用液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)[7]。按照不同試驗(yàn)處理配制液體培養(yǎng)基，用移液器滴一滴在凹形載玻片上。將花蕾的萼片和花瓣剝開(kāi)，用鑷子夾取花藥在液滴表面快速輕蘸一下，使花粉在培養(yǎng)基上分散開(kāi)即可。為保持濕度，將載玻片放在鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，然后放置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)25℃靜置培養(yǎng)3h。培養(yǎng)結(jié)束放4℃冰箱保存。

1.4 花粉發(fā)育指標(biāo)的測(cè)定

1.4.1 萌發(fā)率的測(cè)定 培養(yǎng)后使用萊卡DM 750型顯微鏡進(jìn)行觀測(cè)。當(dāng)花粉管的長(zhǎng)度大于花粉粒的直徑時(shí)被計(jì)為萌發(fā)。統(tǒng)計(jì)萌發(fā)和未萌發(fā)的花粉粒數(shù)，根據(jù)公式：萌發(fā)率=萌發(fā)的花粉數(shù)/總的花粉數(shù)×100%計(jì)算出萌發(fā)率。每個(gè)試驗(yàn)處理隨機(jī)選取3個(gè)視野，每個(gè)視野所統(tǒng)計(jì)的花粉粒不少于100粒。

1.4.2 花粉管長(zhǎng)度的測(cè)定 選取已萌發(fā)的花粉用顯微鏡隨機(jī)選取3個(gè)視野拍照，用Image-Pro Plus圖像分析軟件測(cè)量花粉管的長(zhǎng)度。每個(gè)樣品至少測(cè)定50個(gè)花粉管，計(jì)算平均長(zhǎng)度和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.5 單因素試驗(yàn)

以30mmol/L的MES為母液，加入10%蔗糖+0.05%Ca2+（CaCl2）+0.02%H3BO4+10%PEG-4000等成分，調(diào)至pH6.0，作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在探討碳源、Ca2+和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等單因素的影響時(shí)，保持基礎(chǔ)培養(yǎng)基的其他組分不變，只改變探討因素的種類和濃度，在相同條件下培養(yǎng)并測(cè)定花粉發(fā)育指標(biāo)。

1.5.1 碳源的選擇試驗(yàn) 分別使用蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、可溶性淀粉和山梨醇作為碳源，濃度均為10%。

1.5.2 Ca2+源的選擇試驗(yàn) 分別使用CaCl2和Ca（NO3）2作為Ca2+來(lái)源，Ca2+濃度均為0.05%。

1.5.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇試驗(yàn) 分別在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（CK）中加入10mg/L的萘乙酸（NAA）、100mg/L的赤霉素（GA3）、10mg/L的2,4-D和50mg/L的6-BA等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[8]。

1.6 Plackett-Burman（PB）設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)確定的培養(yǎng)基組分及前期工作確定的各組分濃度范圍，對(duì)影響花粉萌發(fā)的8個(gè)因素進(jìn)行考察。按PB設(shè)計(jì)安排主要影響因素的篩選試驗(yàn)，每個(gè)因素選取低濃度和高濃度分別作為PB試驗(yàn)中的水平“-1”、“+1”，響應(yīng)值為花粉管長(zhǎng)度（μm），自變量及其代號(hào)編碼和水平見(jiàn)表1[9]。

表1 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的因素水平及編碼

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用MINITAB 15數(shù)據(jù)分析軟件和Microsoft Ex?cel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)的單因素選擇試驗(yàn)

2.1.1 碳源的選擇 由圖1可知，在幾種常見(jiàn)碳源中蔗糖是最易被大豆花粉利用的，使用蔗糖的萌發(fā)率（68.96±3.01%）及花粉管長(zhǎng)度（295.41±26.51μm）均為最高值；其次為麥芽糖，萌發(fā)率為（60.00±4.22%），花粉管長(zhǎng)度為（249.77±15.23μm）；葡萄糖和山梨醇等碳源對(duì)大豆花粉萌發(fā)的促進(jìn)作用較小。各碳源對(duì)萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度的影響達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。由此確定選擇蔗糖作為大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)的碳源。

圖1 碳源對(duì)花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的影響

2.1.2 Ca2+源的選擇 由圖2可知，使用CaCl2作為Ca2+來(lái)源進(jìn)行培養(yǎng)的萌發(fā)率為（68.96±3.01%），花粉管長(zhǎng)度為（295.41±26.51μm），均高于使用Ca（NO3）2作為Ca2+來(lái)源的萌發(fā)率（57.98±4.93%）和花粉管長(zhǎng)度（219.33±29.61μm），差異達(dá)到顯著水平（P<0.05）。由此確定選擇CaCl2作為大豆花粉萌發(fā)培養(yǎng)的Ca2+來(lái)源。

2.1.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的選擇 由圖3可以看出，不同的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)大豆花粉萌發(fā)有不同的影響。添加GA3后萌發(fā)率和花粉管長(zhǎng)度分別為（75.65±2.74%）和（325.19±13.59μm），均高于對(duì)照的萌發(fā)率（68.96±3.01%）和花粉管長(zhǎng)度（295.41±26.51μm）；添加NAA后萌發(fā)率（72.32±3.74%）比對(duì)照略有增加，花粉管長(zhǎng)度（277.61±13.81μm）有所降低；添加2,4-D和6-BA均抑制了花粉的萌發(fā)。各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。因此在培養(yǎng)基中加入合適濃度的GA3對(duì)花粉萌發(fā)有促進(jìn)作用。

圖2 Ca2+種類對(duì)花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的影響

圖3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)花粉萌發(fā)率及花粉管長(zhǎng)度的影響

2.2 大豆花粉萌發(fā)主要影響因素的確定

利用MINITAB 15軟件對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果（表2）進(jìn)行分析，得到響應(yīng)值（花粉管長(zhǎng)度）與各因素間的回歸模型：

式中：Y為花粉管長(zhǎng)度的預(yù)測(cè)值，x1、x2、…x8為自變量編碼值。

由表3方差分析可知，該模型顯著（P＜0.05）；模型的調(diào)整確定系數(shù)為R2Adj=0.9745，說(shuō)明該模型能解釋97.45%響應(yīng)值的變化，試驗(yàn)誤差小，因而該模型是合適的。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析

分析因素影響的標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)（圖4）可知，柱狀圖超出虛線的因素是輸出均值的重要影響因素，可以看出x6、x1、x5為顯著影響因素（表3中P＜0.05，在95%概率水平上差異顯著）。說(shuō)明初始pH、蔗糖、GA3為大豆花粉萌發(fā)的主要影響因素，且由T值可知3個(gè)因素均為正效應(yīng)，增加其水平會(huì)促進(jìn)花粉的萌發(fā)。

圖4 標(biāo)準(zhǔn)化效應(yīng)的Pareto圖

3 討論

采用單因素試驗(yàn)確定初始培養(yǎng)基后，再用PB設(shè)計(jì)法，可以以較少的試驗(yàn)次數(shù)快速地從眾多相關(guān)影響因素中篩選出主要影響因素，為進(jìn)一步的優(yōu)化試驗(yàn)指明方向。對(duì)大豆花粉萌發(fā)的影響因素進(jìn)行了研究，確定了培養(yǎng)基中添加蔗糖、CaCl2和GA3可以促進(jìn)花粉萌發(fā)；并篩選出初始pH、蔗糖和GA3為影響花粉萌發(fā)的主要因素，為后續(xù)進(jìn)行的響應(yīng)面法優(yōu)化大豆花粉培養(yǎng)條件的試驗(yàn)提供了依據(jù)[10]。

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