曾振國(guó) 邵強(qiáng) 李勇 丁成志 卿城 劉芬 詹以安 聶成 揭克敏 龔洪翰 錢(qián)克儉

【摘要】目的 觀察白藜蘆醇對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞微小RNA-146a（miR-146a）表達(dá)的影響。方法 將體外培養(yǎng)的大鼠肺泡巨噬細(xì)胞（NR8383）按2×106個(gè)/孔接種于六孔板，細(xì)胞貼壁90 min后，分為磷酸鹽緩沖液（PBS）對(duì)照組、終質(zhì)量濃度LPS（1 μg/mL）處理組、白藜蘆醇（1 μg/mL）預(yù)處理30 min+終質(zhì)量濃度LPS（1 μg/mL）處理組、白藜蘆醇（1 0 μg/mL）預(yù)處理30 min+終質(zhì)量濃度LPS（1 μg/mL）處理組。細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-146a的表達(dá)變化，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果 與PBS對(duì)照組相比，LPS處理組細(xì)胞中miR-146a和TNF-α蛋白表達(dá)量均明顯升高[miR-146a表達(dá)倍數(shù)（5，92±1，57） 倍vs. （1，03±0，58） 倍，P<0，01；TNF-α質(zhì)量濃度 （644，2±36，82） pg/mL vs. （26，15±13，43 ） pg/mL，P<0，01]。與LPS處理組相比，白藜蘆醇預(yù)處理組（1 μg/mL和10 μg/mL）細(xì)胞中miR-146a表達(dá)量均明顯升高[miR-146a表達(dá)倍數(shù)（8，67±1，18） 倍、（11，17±1，40） 倍 vs. （5，92±1，57）倍，P<0，01]，TNF-α蛋白質(zhì)量濃度均顯著降低[TNF-α質(zhì)量濃度（447，7±41，48） pg/mL、（345，0±42，54 ）pg/mL vs. （644，2±36，82 ） pg/mL，P<0，01]，且相比于較低質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)、抑制TNF-α蛋白的分泌（P<0，01）。結(jié)論 白藜蘆醇可以上調(diào)肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)水平，推測(cè)miR-146a參與了白藜蘆醇的抗炎過(guò)程。

【關(guān)鍵詞】 白藜蘆醇；微小RNA-146a；肺泡巨噬細(xì)胞；腫瘤壞死因子-α

Effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide-induced micRoRNA-146a in alveolaR macRophages Zeng Zhenguo，Shao Qiang，Li Yong，Ding Chengzhi， Qing Cheng， Liu Fen， Zhan Yian， Nie Cheng， Jie Kemin， Gong Honghan， Qian Kejian. DepaRtment of CRitical CaRe Medicine， FiRst Affiliated Hospital， Medical College of Nanchang UniveRsity， Nanchang 330006， China

CoRResponding authoR： Qian Kejian，Email：qkj0607@sohu，com

【AbstRact】Objective To obseRve the effect of ResveRatRol on expRession of lipopolysacchaRide （LPS） -induced micRoRNA-146a （miR-146a） in alveolaR macRophages. Methods Rat alveolaR macRophages（NR8383）weRe seeded at 2×106cell/poRe in 6 well plates in vitRo and incubated foR 90 min. NR8383 weRe Randomly divided into fouR gRoups： contRol gRoup， NR8383 stimulated with phosphate buffeR solution （PBS）； LPS-stimulated gRoup， NR8383 stimulated with 1μg/mL of LPS； ResveRatRol-tReated gRoup， NR8383 tReated with diffeRent concentRations of ResveRatRol （1 μg/mL oR 10 μg/mL） foR 30 min， then stimulated with 1 μg/mL of LPS. AfteR incubation foR 6 h， the cells weRe haRvested and the supeRnatant of cell cultuRe medium was collected. The expRession of miR-146a of cells was detected by using fluoRoilluminance Real-time quantitative PCR device， and the levels of TNF-α pRotein in the supeRnatant weRe assayed by using enzyme-linked immunosoRbent assay （ELISA）.Results CompaRed with contRol gRoup， the expRession of miR-146a and the level of TNF-α weRe significantly incReased in LPS stimulated gRoup （miR-146a s expRession folds： 5，92±1，57 vs 1，03±0，58，P<0，01；TNF-α：644，2±36，82 pg/mL vs. 26，15±13，43 pg/mL， P<0，01）. CompaRed with LPS-stimulated gRoup， the expRessions of miR-146a weRe significantly incReased in ResveRatRol-tReated gRoups （1 μg/mL and 10 μg/mL） （miR-146a s expRession folds： 8，67±1，18， 11，17±1，40 vs. 5，92±1，57， both P<0，01）， but the level of TNF-α in the supeRnatant was significantly Reduced （TNF-α： 447，7±41，48 pg/mL， 345，0±42，54 pg/mL vs. 644，2±36，82 pg/mL， both P<0，01），CompaRed with the low concentRation of gRoup（1 μg/mL）， the expRession of miR-146a weRe significantly incReased and the pRoduction of TNF-α in the supeRnatant of cells was significantly Reduced in high concentRation of ResveRatRol gRoup （10 μg/mL） （P<0，01）.Conclusions ResveRatRol could up-Regulate the expRession of miR-146a in alveolaR macRophage inflammatoRy Response， suggesting miR-146a involved in the anti-inflammtoRy pRocesses with ResveRatRol tReatment.

【Key woRds】ResveRatRol； MicRoRNA-146a； AlveolaR macRophages； TumoR necRosis factoR-α

大量臨床及實(shí)驗(yàn)研究表明，白藜蘆醇對(duì)膿毒癥肺損傷具有保護(hù)作用[1-5]。微小RNA-146a（miR-146a）是TLRs/NF-κB炎癥通路中重要的負(fù)反饋調(diào)控介質(zhì)，能夠抑制炎癥反應(yīng)[6]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a參與了肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，有望成為抑制肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的新途徑[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇與miRNA關(guān)系密切，有可能通過(guò)miRNA發(fā)揮其抗炎作用[9-11]。然而，在肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)模型中，白藜蘆醇是否影響miR-146a的表達(dá)以及是否通過(guò)上調(diào)miR-146a的表達(dá)來(lái)抑制炎癥介質(zhì)釋放均未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1，1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠肺泡巨噬細(xì)胞株NR8383（中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)），胎牛血清（美國(guó)HyClone），Ham s F-12K培養(yǎng)基（美國(guó)Sigma-AldRich），LPS（E，coli 0111∶ B4，美國(guó)Sigma-AldRich），白藜蘆醇（美國(guó)Enzo life sciences），TRIzol Reagent（美國(guó)InvitRogen），四甲基偶氮唑鹽（MTT，北京索來(lái)寶科技有限公司），TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)試劑盒、TaqMan MicRoRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan MicRoRNA 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)ABI），十二烷基硫酸鈉（SDS，美國(guó)Sigma-AldRich），大鼠TNF-α ELISA試劑盒（上海明睿生物），氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1，2 細(xì)胞培養(yǎng)

R8383細(xì)胞培養(yǎng)于含15%FBS、1，5 g/L碳酸氫鈉、2 mmol L-谷氨酰胺的Ham s F-12K完全培養(yǎng)基中，置于大氣壓下37 ℃、含5%體積分?jǐn)?shù)CO₂的溫濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換培養(yǎng)液，3～4 d傳代1次。

1，3 MTT比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)細(xì)胞活性的影響

取指數(shù)生長(zhǎng)期NR8383細(xì)胞，按每孔細(xì)胞0，5×10⁴個(gè)接種至96孔板。細(xì)胞貼壁90 min后，分別加入0，1、1、10、50、100 μg/mL終質(zhì)量濃度的白藜蘆醇，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組（等體積PBS替代白藜蘆醇）和陽(yáng)性對(duì)照組（等體積10%二甲亞砜替代白藜蘆醇）。加藥后細(xì)胞再培養(yǎng)48 h，加入5 g/L MTT 溶液20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入三聯(lián)溶解液100 μL/孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育8 h，用酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570 nm）測(cè)定各孔的吸光度（OD 570 nm）值。

1，4 細(xì)胞處理及分組

取指數(shù)生長(zhǎng)期NR8383細(xì)胞，按每孔細(xì)胞2×106個(gè)接種至6孔板。細(xì)胞培養(yǎng)90 min后，分為以下四組：（1） LPS處理組：培養(yǎng)板中加入LPS溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL）；（2） PBS對(duì)照組：培養(yǎng)板中加入等體積PBS溶液；（3） 白藜蘆醇+LPS組：培養(yǎng)板中加入不同濃度白藜蘆醇溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL、10 μg/mL）預(yù)處理30 min后，加入LPS溶液（終質(zhì)量濃度1 μg/mL）。細(xì)胞培養(yǎng)6 h后，離心收集細(xì)胞上清液和細(xì)胞團(tuán)塊，保存于-80 ℃冰箱，分別用于ELISA檢測(cè)和細(xì)胞總RNA提取。

1，5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1，5，1 TNF-α蛋白測(cè)定 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，檢測(cè)按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1，5，2 miR-146a表達(dá)測(cè)定 采用TRIzol法提取細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA完整性及純度，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。采用TaqMan MicRoRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min。采用TaqMan UniveRsal 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃ 10 Rain；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，在ABI 7500定量PCR儀上擴(kuò)增和檢測(cè)。操作均按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，所有操作均在冰上完成。選取U6 snRNA作為內(nèi)參照，miR-146a的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct計(jì)算。

1，6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13，0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0，05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2，1 MTT比色法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)NR8383

細(xì)胞活性的影響

白藜蘆醇在0，1～100 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)NR8383細(xì)胞無(wú)毒性作用。見(jiàn)圖1。

2，2 TNF-α蛋白含量及細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)變化

表1顯示，與PBS對(duì)照組相比，LPS處理組TNF-α蛋白含量及miR-146a表達(dá)均明顯升高（P<0，01）；與LPS處理組相比，白藜蘆醇預(yù)處理組能明顯減少TNF-α蛋白含量，并進(jìn)一步上調(diào)miR-146a表達(dá)，且相比于較低質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)、抑制TNF-α蛋白的分泌（P<0，01）。這表明白藜蘆醇能抑制肺泡巨噬細(xì)胞TNF-α蛋白表達(dá)和上調(diào)miR-146a表達(dá)。

3 討論

膿毒癥并發(fā)急性肺損傷是膿毒癥高病死率的主要原因[12，13]，如果發(fā)生膿毒癥時(shí)避免或減輕肺損傷的發(fā)生，將有助于提高膿毒癥患者的成功救治率。肺組織中最多的非實(shí)質(zhì)性細(xì)胞是肺泡巨噬細(xì)胞[14]，膿毒癥發(fā)生時(shí)，肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB炎癥通路活化，導(dǎo)致大量炎癥基因的轉(zhuǎn)錄活化，失控性釋放大量炎癥因子，形成肺內(nèi)炎癥“瀑布”反應(yīng)，導(dǎo)致ALI的發(fā)生。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要致病成分，是導(dǎo)致TLRs/NF-κB活化的常見(jiàn)因子。本研究結(jié)果顯示，LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，導(dǎo)致TNF-α分泌顯著增加。

白藜蘆醇是一種多酚類(lèi)化合物，是天然的植物抗菌素。它能夠抑制肺泡巨噬細(xì)胞的活化，減少細(xì)胞內(nèi)炎癥因子的釋放，避免或減輕膿毒癥時(shí)肺損傷，提高膿毒癥時(shí)肺損傷的治療效果[1-5，15]。本實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)，白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后，能明顯抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α 的產(chǎn)生，并且其抑制作用呈劑量依賴(lài)性。

miRNAs是一類(lèi)小的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)識(shí)別靶基因mRNA的3 端非編碼區(qū)來(lái)抑制靶蛋白的翻譯或促進(jìn)靶基因的降解[16-17]。miRNAs通過(guò)抑制炎癥相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在炎癥反應(yīng)調(diào)控中具有重要作用。miR-146a在TLRs/NF-κB通路中具有重要調(diào)控作用。它的靶基因是TLRs/NF-κB通路中的兩個(gè)重要接頭蛋白編碼基因IRAK-1和TRAF-6。miR-146a上調(diào)后將負(fù)性調(diào)控TLRs/NF-κB通路，能夠抑制炎癥介質(zhì)的升高[6，18]。并且已證實(shí)miR-146a參與調(diào)節(jié)了LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[7-8]。在本實(shí)驗(yàn)中，用LPS刺激肺泡巨噬細(xì)胞后，也誘導(dǎo)了miR-146a的表達(dá)上調(diào)，與前者報(bào)道結(jié)果相似。

研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇通過(guò)影響miRNA前體的轉(zhuǎn)錄和miRNA的加工成熟，能特異性地引起一些miRNAs改變，包括miR-21、miR-146a、miR-663等，這些miRNAs都參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控[9-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇預(yù)處理大鼠肺泡巨噬細(xì)胞后，能明顯促進(jìn)miR-146a的表達(dá)上調(diào)，并且相比于較低質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（1 μg/mL組），較高質(zhì)量濃度白藜蘆醇組（10 μg/mL）更能誘導(dǎo)miR-146a的表達(dá)。

綜上所述，在LPS誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)中，白藜蘆醇能夠抑制炎癥因子TNF-α的產(chǎn)生，并上調(diào)miR-146a的表達(dá)，由此筆者可以推測(cè)，白藜蘆醇調(diào)控炎癥的機(jī)制之一可能是通過(guò)升高細(xì)胞內(nèi)miR-146a的表達(dá)水平來(lái)發(fā)揮其抗炎作用。

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（收稿日期：2013-05-07）

（本文編輯：鄭辛甜）

DOI：10，3760/cma，j，issn，1671-0282，2014，01，009

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（81060152）；江西省自然科學(xué)基金（2009GZY0215）

作者單位：330006 南昌，南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科（曾振國(guó)、邵強(qiáng)、丁成志、卿城、劉芬、詹以安、聶成、錢(qián)克儉），腫瘤科（李勇），影像科（龔洪翰）；南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（揭克敏）

通信作者：錢(qián)克儉，Email：qkj0607@sohu，com

P30-33