劉 群，李天祥，李慶和，張伯禮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

·綜述·

藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展*

劉 群，李天祥，李慶和，張伯禮

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

細(xì)胞懸浮培養(yǎng)；次生代謝產(chǎn)物；研究進(jìn)展

自20世紀(jì)50年代至今，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)取得了重大的發(fā)展。目前被研究的植物有1 000多種，獲得天然活性產(chǎn)物達(dá)500多種[1]。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)是植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，中國已建立了人參、西洋參、紫草等藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，有效成分含量已達(dá)到或超過原植株[2]。

1 影響次生代謝產(chǎn)物積累的培養(yǎng)條件

1.1 愈傷組織及其接種量 生長力旺盛、表面顆粒突起、質(zhì)地疏松、淡黃色的胚性愈傷組織是建立細(xì)胞懸浮系和提高次生代謝產(chǎn)物積累量的基礎(chǔ)[3]。

懸浮細(xì)胞的生長具有群聚效應(yīng)，細(xì)胞密度低，生長緩慢；細(xì)胞密度高，生長迅速，液泡變大，易積累有害物質(zhì)，不利于懸浮細(xì)胞系的建立[4]。一般藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的接種量在20.0～100.0 g/L。接種量的大小不僅影響細(xì)胞的生長量，也影響次生代謝的積累。王關(guān)林等[5]發(fā)現(xiàn)，在同一培養(yǎng)天數(shù)不同接種量的梔子懸浮細(xì)胞的收獲量不同，而且在指數(shù)后期和靜止期多糖含量顯著下降。

1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基中的碳源、氮源、維生素、氨基酸以及植物生長激素等組成成分也影響了植物細(xì)胞的生長和代謝。

1.2.1 碳源 在藥用植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中最常用為蔗糖，濃度為2%～5%。提高藥用植物細(xì)胞生長的碳源濃度，并不一定相應(yīng)促進(jìn)其次生代謝產(chǎn)物的積累。郭肖紅等[6]發(fā)現(xiàn)，30 g/L蔗糖可使丹參不定根增殖倍數(shù)最高，60 g/L蔗糖最適合丹參酮ⅡA合成，低質(zhì)量濃度蔗糖更利于原兒茶醛合成。

不同種類的碳源對(duì)植物細(xì)胞代謝有不同的影響。彭昕等[7]研究三葉青細(xì)胞懸浮培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)以5%麥芽糖為碳源時(shí)細(xì)胞增殖倍數(shù)最高；以5%蔗糖為碳源時(shí)總黃酮含量最高。因此，應(yīng)根據(jù)不同研究目的來篩選碳源的種類和濃度。

1.2.2 氮源 一般情況下，硝態(tài)氮水平高利于細(xì)胞增殖和胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，銨態(tài)氮水平高促進(jìn)組織的器官分化和體細(xì)胞胚胎形成[8]。高艷麗等[9]發(fā)現(xiàn)，硝態(tài)氮和銨態(tài)氮比例為5∶1時(shí)，甘草細(xì)胞獲最大生物量，以銨態(tài)氮為氮源，黃酮類含量最高。

1.2.3 植物生長激素 生長素與細(xì)胞分裂素比值適中時(shí),促進(jìn)愈傷組織生長[10]。激素種類和配比對(duì)植物細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累有著顯著的影響。Zhao J等[11]在玫瑰紅細(xì)胞懸浮培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-乙酸（IAA）與激動(dòng)素（KT）或6-芐胺基腺嘌呤（6-BA）的組合更利于提高生物堿含量。李蕤等[12]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)6-芐胺基腺嘌呤（6-BA）與吲哚-3-乙酸（IAA）為1.0∶0.4時(shí)細(xì)胞收獲量最大。

1.3 物理因素的培養(yǎng)條件 在懸浮培養(yǎng)過程中，光照、溫度、pH值、搖床轉(zhuǎn)速、細(xì)胞生長周期等也不容忽視。

1.3.1 光照 光照通過光合作用和光形態(tài)建成這兩種途徑影響黃酮類、蒽醌類等次生代謝物的積累[13]。一般所需光強(qiáng)在1 000～2 000 lx，光照時(shí)間為每天14 h。光照強(qiáng)度的大小和光質(zhì)應(yīng)根據(jù)不同植物和研究目的來選擇。李春斌等[14]發(fā)現(xiàn)，在2 000 lx光強(qiáng)范圍內(nèi)，銀杏細(xì)胞增長隨光強(qiáng)的加大而增強(qiáng)，光強(qiáng)大于2 000 lx時(shí)，有下降趨勢(shì)，但培養(yǎng)物中黃酮的含量卻隨光強(qiáng)的增加而增加。另外，紅光最利于銀杏細(xì)胞的生長，但黃酮含量最低，藍(lán)光下細(xì)胞生長最慢，白光下細(xì)胞的生物量和黃酮含量居中。

1.3.2 pH值 目前研究認(rèn)為pH值影響培養(yǎng)細(xì)胞的質(zhì)膜透性、細(xì)胞呼吸代謝及胞內(nèi)離子競(jìng)爭(zhēng)等[15]。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)所需pH值為5.5～6.0。不同的pH值對(duì)細(xì)胞內(nèi)不同有效物質(zhì)的積累影響是不一樣的，王娟等[13]研究發(fā)現(xiàn)較低的pH值有利于人參皂苷Rb1的合成，較高的pH值有利于西洋參多糖的合成。

1.3.3 溫度 溫度過高或過低都不利于植物細(xì)胞的生長和次生代謝產(chǎn)物的積累。在研究主要因素對(duì)菘藍(lán)下胚軸細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響的過程中，發(fā)現(xiàn)溫度的影響最大，20℃為最適溫度[16]。

1.3.4 搖床轉(zhuǎn)速 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)細(xì)胞生長也有一定的影響。研究發(fā)現(xiàn)[17]，長春花愈傷組織細(xì)胞120 r/min轉(zhuǎn)速下20 d后的平均值鮮重最大。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)周期 藥用植物細(xì)胞的培養(yǎng)生長周期呈“S”型曲線，培養(yǎng)周期一般為14～20 d[18]。次生代謝產(chǎn)物的合成量也會(huì)隨細(xì)胞不同生長期而改變，一般是同步的，華萍等[19]發(fā)現(xiàn)茶葉細(xì)胞生長和茶氨酸積累高峰期在第19天～第22天出現(xiàn)，以培養(yǎng)19～22d為宜。

2 提高次生代謝產(chǎn)物積累的方法

2.1 誘導(dǎo)子的加入 誘導(dǎo)子為能引起植物胞內(nèi)代謝趨向于向次生代謝產(chǎn)物合成方向轉(zhuǎn)變的脅迫因子[20]。一種誘導(dǎo)子的添加不一定對(duì)同一種植物的多種次生代謝產(chǎn)物的積累都起到促進(jìn)作用。研究顯示[21]，茉莉酸甲酯的添加對(duì)葡萄的總酚和白藜蘆醇的含量的提高都有促進(jìn)作用，但對(duì)花青素的含量有抑制作用。趙微等[22]發(fā)現(xiàn)高溫和低溫均顯著促進(jìn)了白樺總?cè)频暮铣珊捅┑姆e累。

2.2 前體化合物的加入 在細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中加入次生代謝產(chǎn)物的前體化合物對(duì)提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量是非常有效的[23]。加入前體物質(zhì)異戊二烯、牻牛兒醇對(duì)銀杏懸浮細(xì)胞的生長及銀杏內(nèi)酯B的積累均有一定的促進(jìn)作用[24]。

2.3 培養(yǎng)方法的改進(jìn) 在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，還可以建立有效的培養(yǎng)方法來獲得高產(chǎn)量有效物質(zhì)。

2.3.1 發(fā)狀根培養(yǎng) 發(fā)狀根是植物受到發(fā)根農(nóng)桿菌的侵染時(shí)產(chǎn)生的呈發(fā)狀分支的不定根[25]。發(fā)狀根生長迅速，產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物的含量高[26]。研究表明[27]，發(fā)狀根中的總生物堿含量高于長春花的原植株和愈傷組織。發(fā)狀根培養(yǎng)具有生長迅速、激素自養(yǎng)、次生代謝產(chǎn)物穩(wěn)定且往往比植物自身合成的含量還要高等多方面的優(yōu)點(diǎn)[28]。但是大多數(shù)單子葉植物受發(fā)根農(nóng)桿菌感染后不能產(chǎn)生發(fā)狀根。

2.3.2 兩相培養(yǎng) 兩相培養(yǎng)是通過細(xì)胞在水相中生長，合成的脂溶性次生代謝物質(zhì)可以轉(zhuǎn)移至有機(jī)相中來提高代謝物的量。目前運(yùn)用較多的是兩液相培養(yǎng)[29]。吳兆亮等[30]研究表明，在懸浮培養(yǎng)過程中加入有機(jī)溶劑可使紅豆杉的紫杉醇的釋放率提高近2倍。

2.3.3 基因工程的應(yīng)用 利用基因工程技術(shù)對(duì)植物細(xì)胞體內(nèi)基因進(jìn)行調(diào)控來提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量是目前一種先進(jìn)的應(yīng)用方法。通過反義技術(shù)，可以將反義DNA或RNA片段導(dǎo)入植物細(xì)胞，使控制代謝的關(guān)鍵酶活性受調(diào)控，從而提高目的物的含量[31]。在薄荷中導(dǎo)入反義構(gòu)建的薄荷呋喃合成酶基因，降低了薄荷油中薄荷呋喃的含量，改善了薄荷油的品質(zhì)[32]。

3 討論

經(jīng)過近幾十年的發(fā)展，植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)日趨成熟，人參產(chǎn)生的人參皂苷、紫草產(chǎn)生的紫草寧、黃連產(chǎn)生的小檗堿等已經(jīng)通過植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)[33]。但高產(chǎn)而又穩(wěn)定的細(xì)胞系難以篩選；植物細(xì)胞的生長周期過長，以及污染和褐化問題難以徹底解決；植物細(xì)胞要求的生長環(huán)境復(fù)雜，生物細(xì)胞反應(yīng)器工藝難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)要求；植物細(xì)胞培養(yǎng)成本高，但代謝產(chǎn)物含量不穩(wěn)定，其不一定高于原植物，某些植物細(xì)胞次生代謝信號(hào)調(diào)控十分復(fù)雜[34]，難以控制?？梢?，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生有效次生代謝產(chǎn)物的技術(shù)有待進(jìn)一步完善。

4 展望

放眼未來，利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)快速生產(chǎn)有效代謝產(chǎn)物的方法將會(huì)有廣闊的發(fā)展空間。要想實(shí)現(xiàn)植物細(xì)胞培養(yǎng)的工業(yè)化，需要從以下方面努力：獲取和篩選高產(chǎn)，穩(wěn)定的細(xì)胞系；探索并掌握植物細(xì)胞次生代謝信號(hào)調(diào)控機(jī)制，合理、準(zhǔn)確地調(diào)控其懸浮細(xì)胞生長和代謝，以提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量；改善植物生物反應(yīng)器的工藝和技術(shù)，提供植物細(xì)胞培養(yǎng)的最適環(huán)境；充分利用基因工程先進(jìn)技術(shù)，對(duì)次生代謝中的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行修飾和改造，提高次生代謝物的產(chǎn)量[35]。無疑，通過上述途徑，在不久的將來，成熟的細(xì)胞培養(yǎng)工業(yè)化生產(chǎn)體系能為人類防治疾病提供豐富的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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R285.5

：A

：1673－9043（2014）06－0375-03

2014-08-17）

10.11656/j.issn.1673-9043.2014.06.16

天津市科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（10ZCZDSY12400）。

劉 群（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制與資源開發(fā)。

李天祥，E-mail:litianxiang612@sina.com。