魯曉萍，王大濤，孫紅梅，褚文輝，趙海平，章秀婷，李春義

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟(jì)動物分子生物學(xué)省部共建實(shí)驗(yàn)室，長春130112)

鹿茸為雄性鹿頭蓋骨部分的附屬器官，不同于其他反芻動物中空的角組織，其為皮膚包裹的骨組織，富含有血管、神經(jīng)。鹿茸是唯一一個能夠每年周期性和完全再生的哺乳動物器官。鹿茸再生過程伴隨著皮膚、血管、神經(jīng)的再生，生長速度為1cm/d～2cm/d且無癌變發(fā)生。鹿茸再生的過程中，鹿角脫落面無傷疤形成，同時鹿茸作為鹿頭部表面附屬器官方便觀察和獲取，發(fā)育和再生在同一機(jī)體上產(chǎn)生有利于比較，發(fā)育和再生過程可以人工誘導(dǎo)等優(yōu)勢，因此將成為一個很好的再生醫(yī)學(xué)研究模型。為了更好地發(fā)展鹿茸這一再生醫(yī)學(xué)模型，必須對鹿茸發(fā)育機(jī)制進(jìn)行更深的研究。鹿茸發(fā)育過程包括發(fā)生和再生2個階段，鹿茸再生重演鹿茸發(fā)生的過程。鹿茸發(fā)生過程包括角柄形成和鹿茸發(fā)育2個過程。鹿茸角柄和鹿茸都是由外部皮膚和內(nèi)部骨組織2部分組成，其中富含有神經(jīng)和血管。鹿茸發(fā)育過程先有內(nèi)部骨組織形成變化，然后外部鹿茸角柄遠(yuǎn)端皮膚由鹿皮轉(zhuǎn)變?yōu)槿灼?。鹿茸的發(fā)育、再生是基于鹿茸生茸區(qū)骨膜(antlerogenic periosteum，AP)和角柄骨膜(pedicle periosteum，PP)同其上覆蓋的皮膚相互作用的過程。實(shí)驗(yàn)證明這個相互作用過程是基于干細(xì)胞的分裂、分化過程，AP細(xì)胞為鹿茸干細(xì)胞[1]，是鹿出生后遺留的胚胎組織[2]。鹿茸發(fā)育的機(jī)制受多種因素的調(diào)控，如光照、生長因子、激素等調(diào)控。本文就目前鹿茸發(fā)育的組織來源、組織細(xì)胞特性及其組織間的相互作用的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 調(diào)控鹿茸發(fā)生和再生的組織來源

鹿茸發(fā)生時不是直接生長于額骨上，而是從角柄(永久性骨樁組織)上長出，角柄不是與生俱來的，角柄來源于額外脊上的生茸區(qū)骨膜(AP)。母鹿和公鹿額骨處都有AP，但是在大多鹿種中只有雄鹿生茸，而母鹿不能生茸，這是因?yàn)槁谷椎纳尚枰行奂に氐拇碳3]。組織學(xué)觀察和遺傳標(biāo)記追蹤細(xì)胞分裂趨向證明角柄和鹿茸都來源于AP細(xì)胞的分裂和分化[4]。此外組織學(xué)實(shí)驗(yàn)證明鹿茸發(fā)生和再生來源于角柄骨膜，經(jīng)過PP全部和部分切除實(shí)驗(yàn)證實(shí)PP為鹿茸再生組織，PP由AP分化而來[5]。骨膜異位移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了AP具備胚胎組織的特性，在體外培養(yǎng)時，具有巨大的再生潛力，AP細(xì)胞表面富含糖原[6]。通過實(shí)驗(yàn)方法切除掉AP導(dǎo)致角柄不能發(fā)生，將AP進(jìn)行同體異位移植將產(chǎn)生異位角柄和鹿茸，AP切除和移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)了誘導(dǎo)鹿茸發(fā)生的AP閾值面積是15mm2，AP細(xì)胞可以分化成鹿茸，同時AP包含有鹿茸形態(tài)生成的信息[7]，將AP分成前、后、中間、側(cè)邊4個部分進(jìn)行異位移植進(jìn)一步證實(shí)了AP包含有鹿茸形態(tài)的信息[8]。

異位移植AP需要與覆蓋其上的鹿額外脊皮膚相互作用，才能使鹿茸發(fā)生和皮膚轉(zhuǎn)變?yōu)槿灼?。但是鹿的鼻子、脊背部、尾巴腹?cè)3個部位的皮膚不可以和AP進(jìn)行這種相互作用，因?yàn)檫@3個部位缺少毛囊細(xì)胞[9]。通過在皮膚和AP之間插入不透膜實(shí)驗(yàn)證實(shí)了異位移植AP需要與相應(yīng)的皮膚相互作用才能導(dǎo)致鹿茸的生成和鹿皮膚類型的轉(zhuǎn)變[10]。只有皮膚和骨膜接觸緊密時，骨膜才能和皮膚相互作用[11]，內(nèi)部不斷生長的角柄由雄性激素刺激，不同鹿種這2種組織達(dá)到緊密接觸的時間不同，因此生長出鹿茸時，角柄的高度也不一樣[12]。PP組織發(fā)育成鹿茸時，只有角柄主干遠(yuǎn)端與皮膚緊密接觸，該區(qū)域大約為角柄高度的1/3(稱為致敏區(qū))部分能夠誘導(dǎo)鹿茸產(chǎn)生，而近端與皮膚松散接觸，該區(qū)域大約為角柄高度的2/3(稱為休眠區(qū))部分不能誘導(dǎo)鹿茸產(chǎn)生[13]，并且這2個區(qū)域的劃分是個動態(tài)過程，伴隨著年齡增長，角柄變短，依舊是角柄主干遠(yuǎn)端大約1/3處同皮膚接觸緊密，角柄主干近端大約2/3處同皮膚接觸松散。插膜實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)了鹿茸再生過程也需要PP和覆蓋的皮膚相互作用，鹿茸發(fā)生和再生均需要AP、PP和其上的皮膚發(fā)生緊密接觸后才能誘導(dǎo)鹿茸的發(fā)生和再生[13]。

研究證實(shí)鹿茸再生過程和鹿茸發(fā)生過程相似，鹿茸再生基因表達(dá)研究表明鹿茸再生分子機(jī)制重演鹿茸發(fā)生的過程[14，15]。細(xì)胞水平上的研究表明鹿茸發(fā)育和再生過程都依賴于AP和PP中的細(xì)胞群[16]，鹿茸發(fā)育和再生過程都是由皮膚和骨膜的相互作用激發(fā)的[17]，首先骨膜導(dǎo)致鹿皮膚轉(zhuǎn)化為茸皮，然后茸皮反饋激發(fā)骨膜細(xì)胞分裂增值，形成鹿茸組織。因此，鹿茸發(fā)生和再生的組織來源于AP、PP及其與它們緊密接觸的皮膚。

2 AP、PP細(xì)胞特性及其與覆蓋皮膚組織相互作用的機(jī)制

AP骨膜為直徑大約2.5cm、厚度約為2.5～3.0mm的組織片，大約500萬個細(xì)胞維持著鹿茸季節(jié)性再生。在短短的60d時間內(nèi)，AP大約提供300萬個細(xì)胞，生長出大約10kg鹿茸組織。AP細(xì)胞和PP細(xì)胞都具有巨大的增生潛力。研究證實(shí)AP和PP組織細(xì)胞表面表達(dá)標(biāo)記干細(xì)胞群的CD9抗原，標(biāo)記多潛能細(xì)胞的Oct4、Nanog等抗原，此2種組織具有很高的端粒酶活性(與細(xì)胞自我更新有關(guān))和表達(dá)核干細(xì)胞因子(控制干細(xì)胞分裂和蠑螈肢體再生)。PP細(xì)胞表達(dá)stro-1，為間充質(zhì)祖細(xì)胞的標(biāo)志。AP和PP表達(dá)標(biāo)記的性質(zhì)和范圍都表明AP和PP細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞性質(zhì)。AP和PP細(xì)胞在分別有地塞米松和抗壞血酸鹽的微粒體培養(yǎng)時均能被誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞，AP和PP在形成角柄和鹿茸時分裂出軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞是必須的。當(dāng)AP和PP細(xì)胞在有亞油酸或者兔血清的介質(zhì)中培養(yǎng)時它們均能分化成脂肪細(xì)胞。這些都證明了這些細(xì)胞群為成體干細(xì)胞，具有多潛能分化特性[18，1]。

AP移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)：在鹿茸的皮膚轉(zhuǎn)變?yōu)槿灼で俺鬉P將中斷鹿茸皮膚類型轉(zhuǎn)變和鹿茸形成，皮下移植AP誘導(dǎo)鹿的皮膚向天鵝絨茸皮膚轉(zhuǎn)變和鹿茸生成[9]。異位移植AP和其上的皮膚，并且除掉皮下結(jié)締組織(SLCT)，證實(shí)了SLCT和部分皮膚在茸皮轉(zhuǎn)變過程中不是必須的，在移植的AP和上層皮膚之間插入半透膜2年后正常鹿皮轉(zhuǎn)變?yōu)榈湫偷娜灼ぃ欢迦氩煌改さ穆谷灼つw依舊沒有轉(zhuǎn)變。這個實(shí)驗(yàn)說明皮膚轉(zhuǎn)變需要AP的參與[10]，是AP分化過程中的分子誘導(dǎo)作用促使了鹿茸皮膚類型的轉(zhuǎn)變[19]。這些分子通過長距離旁分泌途徑作用于皮膚組織的毛囊根部，這些被誘導(dǎo)的皮膚毛囊細(xì)胞通過旁分泌或者近分泌途徑釋放小分子物質(zhì)同其上的其他部分皮膚組織相互作用，誘導(dǎo)皮膚轉(zhuǎn)變?yōu)槿灼?。反過來，類型轉(zhuǎn)變的皮膚組織釋放小分子物質(zhì)反饋?zhàn)饔糜贏P細(xì)胞層，誘導(dǎo)鹿茸發(fā)生。在鹿茸的再生過程中，通過PP剝離實(shí)驗(yàn)[5]、PP和皮膚之間的插膜實(shí)驗(yàn)[10]證實(shí)了PP是鹿茸再生不可缺少的組織，PP和其上的皮膚組織也是通過小分子物質(zhì)的擴(kuò)散進(jìn)行相互作用的。由此看來誘導(dǎo)AP、PP同覆蓋其上皮膚組織相互作用的小分子物質(zhì)在鹿茸發(fā)生和再生過程中具有重要意義，因此分離這些小分子物質(zhì)并研究其作用機(jī)制將能更好地理解鹿茸發(fā)育機(jī)制，更好地應(yīng)用于傷口愈合和人類組織再生，將對再生醫(yī)學(xué)有重大的影響。

3 鹿茸發(fā)育研究現(xiàn)狀及待解決的問題

研究證實(shí)鹿茸再生過程是由于PP同其上覆蓋的皮膚相互作用誘導(dǎo)的，誘導(dǎo)這種作用的物質(zhì)不能透過一定厚度的纖維濾膜，主要是一些小肽物質(zhì)(暫稱為小分子物質(zhì))，這種小分子物質(zhì)是通過細(xì)胞旁分泌途徑進(jìn)行的，因此分離這些小分子物質(zhì)將成為研究鹿茸發(fā)育機(jī)制的重點(diǎn)。因?yàn)檫@些小分子物質(zhì)是通過旁分泌的途徑進(jìn)行的，因此可以在培養(yǎng)液中將這些小分子物質(zhì)通過生物技術(shù)的方法進(jìn)行分離。細(xì)胞共培養(yǎng)技術(shù)是將不同的細(xì)胞共培養(yǎng)于同一個環(huán)境中，這種技術(shù)可以模擬體內(nèi)生成的微環(huán)境，便于更好地觀察細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與培養(yǎng)環(huán)境之間的相互作用。目前我室的科研人員已建立了鹿PP細(xì)胞同PP毛囊細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)的平臺，為分離這些有效小分子物質(zhì)做了良好的鋪墊，同樣的細(xì)胞共培養(yǎng)方法可以將刺激鹿茸血管、神經(jīng)再生的物質(zhì)進(jìn)行分離。

PP來源于AP，鹿茸再生過程和鹿茸發(fā)生過程相似，但是PP組織不同于AP組織，AP導(dǎo)致了角柄的產(chǎn)生，PP導(dǎo)致了鹿茸的發(fā)生，皮下移植PP不能導(dǎo)致異位茸發(fā)生[16]，然而皮下移植AP能導(dǎo)致異位角柄和茸發(fā)生，但是該研究沒有進(jìn)一步將角柄主干致敏區(qū)和休眠區(qū)的骨膜分別進(jìn)行異位移植，以及將AP異位移植到角柄骨組織上面，只是初步證實(shí)AP一旦分化成PP就不具備鹿茸發(fā)育的能力，PP只能局限于再生。因此AP組織和PP組織在誘導(dǎo)鹿茸再生能力方面有巨大的不同。這種不同是由于PP位于角柄而AP位于額外脊處這種物理位置造成的生物力學(xué)效應(yīng)導(dǎo)致PP再生能力改變還是由于AP轉(zhuǎn)變?yōu)镻P時細(xì)胞信號通路發(fā)生改變導(dǎo)致的，或者是因?yàn)镻P包括致敏區(qū)和休眠區(qū)2個異質(zhì)的部分，而整個AP區(qū)域與皮膚的相連的緊密程度沒有明顯的不同導(dǎo)致的這些都需要進(jìn)一步地研究，此外角柄主干致敏區(qū)和休眠區(qū)的骨膜分別進(jìn)行異位移植將會有什么不同也需要進(jìn)一步地驗(yàn)證，這些機(jī)制的研究將為如何將PP誘導(dǎo)成AP，然后進(jìn)行異位移植產(chǎn)生更多的鹿茸打下基礎(chǔ)。

導(dǎo)致鹿茸發(fā)育和再生的AP和PP細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，干細(xì)胞在調(diào)控鹿茸發(fā)育和再生的過程中具有復(fù)雜的機(jī)制，目前我們已經(jīng)明確地了解了鹿茸發(fā)育和再生的組織來源及其相互作用機(jī)制，需要進(jìn)一步將生物力學(xué)、生物電學(xué)、分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)等學(xué)科進(jìn)行結(jié)合，從而更有力地去挖掘鹿茸發(fā)育和再生機(jī)制中的未知領(lǐng)域。

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