β—actin基因在荒漠昆蟲光滑鱉甲和小胸鱉甲中表達(dá)的穩(wěn)定性研究

2014-02-13 22:46:41孟閃閃馬文靜劉小寧馬紀(jì)

天津農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年2期

孟閃閃+馬文靜+劉小寧+馬紀(jì)

摘要：為檢測生活習(xí)性截然相反的兩種荒漠昆蟲光滑鱉甲和小胸鱉甲的β-actin基因在不同溫度下的表達(dá)是否穩(wěn)定，對不同溫度處理和不同季節(jié)采集的昆蟲提取總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測。以Ct值作為β-actin基因表達(dá)水平的測定值。通過方差分析顯示：光滑鱉甲的β-actin基因在不同季節(jié)無顯著差異，而小胸鱉甲則表現(xiàn)出β-actin基因表達(dá)的季節(jié)性差異；在不同溫度處理?xiàng)l件下，光滑鱉甲β-actin基因表達(dá)比小胸鱉甲的要穩(wěn)定。研究認(rèn)為β-actin可作為研究光滑鱉甲不同溫度下基因表達(dá)的內(nèi)參基因，而β-actin則不適合用做研究小胸鱉甲在不同溫度下基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

關(guān)鍵詞：β-actin；內(nèi)參基因；光滑鱉甲；小胸鱉甲；實(shí)時(shí)定量PCR

中圖分類號：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.02.001

Expression Stability of β-actin Gene in the Desert Insects Microdera punctipennis and Anatolica polita

MENG Shan-shan，MA Wen-jing，LIU Xiao-ning，MA Ji

（Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering， College of Life Science and Technology， Xinjiang University， Urumqi，Xinjiang 830046， China）

Abstract： In order to measuring the expression stability of the β-actin gene at different temperatures in two desert insects， Microdera punctipennis and Anatolica polita， which have quite contrary living habit，total RNA from the insects collected in different seasons， or treated at different temperatures was extracted and reverse transcribed to synthesize cDNAs. The expression of the β-actin genes from these two species was measured by Ct values which were obtained by real-time quantitative PCR. The results showed that there were no significant changes in the expression of β-actin gene in Anatolica polita over seasons， while in Microdera punctipennis the expression of β-actin gene changed significantly. When the beetles were treated at different temperatures， the expression of β-actin gene in Anatolica polita was more stable than that in Microdera punctipennis. β-actin gene in Anatolica polita could be used as a reference gene for study gene expression at different temperatures， while it is not suitable in Microdera punctipennis for study gene expression at different temperatures.

Key words： β-actin； reference gene； Microdera punctipennis； Anatolica polita； real-time PCR

β-actin是肌細(xì)胞骨架微絲的主要成分，具有收縮功能，參與胞質(zhì)分裂、形態(tài)維持、生長等多種重要的生理活動，是一類高度保守的蛋白質(zhì)[1]。β-actin具有分布廣泛、mRNA表達(dá)量高、數(shù)量穩(wěn)定等特點(diǎn)，因此被稱為看家基因。傳統(tǒng)的RT-PCR及實(shí)時(shí)熒定量PCR（qRT-PCR）等技術(shù)多選用看家基因作為內(nèi)標(biāo)來評價(jià)目的基因的相對表達(dá)量。常用的內(nèi)標(biāo)基因有β-actin、18SrRNA、28SrRNA和GAPDH（甘油醛3-磷酸脫氫酶）等，其中β-actin可在多個物種內(nèi)持續(xù)恒量地表達(dá)，因而常被用做內(nèi)參基因[2-3]。例如，粘蟲的β-actin基因在6種不同組織間的表達(dá)無顯著差異[4]。然而，大量研究表明，看家基因所謂的恒定表達(dá)都只是在一定類型的細(xì)胞或試驗(yàn)因素作用下“有范圍”的恒定，在其他類型的細(xì)胞中或試驗(yàn)因素作用下則是變化的，有時(shí)可能是十幾倍、幾十倍甚至上百倍的差異，盲目地使用一種看家基因作為內(nèi)參，一方面可能使基因表達(dá)的微小差異難以發(fā)現(xiàn)，另一方面可能會導(dǎo)致錯誤甚至相反的結(jié)論[5-6]。通過實(shí)時(shí)定量PCR證明，actin、RPS18和GAPDH在意大利蜂的細(xì)菌脅迫前后表達(dá)最穩(wěn)定，可做為內(nèi)參基因[7]。GAPDH的表達(dá)隨牙鲆的變態(tài)發(fā)育發(fā)生波動，β-actin較為穩(wěn)定，18S是最穩(wěn)定的[8]。因此，研究目標(biāo)基因的表達(dá)情況時(shí)，根據(jù)樣本的不同，選擇合適而穩(wěn)定的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，將有助于得到可靠的試驗(yàn)結(jié)果。

小胸鱉甲（Microdera punctipennis）和光滑鱉甲（Anatolica polita borealis）是兩種分布于古爾班通古特沙漠的荒漠?dāng)M步甲科昆蟲[9-10]。小胸鱉甲成蟲避光喜陰，夏季的白天棲居于灌叢的根部，夜晚活動，冬季藏于沙土中；光滑鱉甲成蟲喜光耐熱，日間活動，早晚溫度較低時(shí)很少出現(xiàn)。古爾班通古特沙漠氣候特征為典型的溫帶大陸性極端干旱氣候，年溫差和晝夜溫差巨大，氣溫變化劇烈。這兩種昆蟲在此極端環(huán)境下都能克服干旱、低溫和高溫的影響，能很好地適應(yīng)環(huán)境溫度變化。利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)從基因表達(dá)水平研究它們的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制，將有助于加強(qiáng)人類對荒漠極端生物類群的認(rèn)識。β-actin基因作為常用的內(nèi)參基因，其在不同溫度條件下在兩種昆蟲中的表達(dá)是否穩(wěn)定需要鑒定，以便確定是否可以作為內(nèi)參基因。

1 材料和方法

1.1 試蟲

荒漠昆蟲小胸鱉甲（M.punctipennis ）和光滑鱉甲（A.polita）均采自于新疆阜康市222團(tuán)（44°24N， 087°51′E）的準(zhǔn)噶爾盆地古爾班通古特沙漠南緣地帶（距離亞洲大陸地理中心約100 km）。采集時(shí)間為3月份積雪開始融化時(shí)，至11月份入冬后。采集的新鮮樣本保存到液氮中，其余樣本在室內(nèi)培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行短期飼養(yǎng)，溫度控制在25 ℃，光周期設(shè)置為16L∶8D，喂食飼料及蔬菜等。

1.2 試蟲的溫度處理

野外采集的小胸鱉甲和光滑鱉甲成蟲在室溫下飼養(yǎng)一天，待其恢復(fù)正常狀況后分別取30只置于10 ℃處理5 h，然后將各組昆蟲轉(zhuǎn)至20，30，40 ℃ 處理5 h，使其形成10，20，30 ℃的溫差。各組取出4只速凍于液氮中。另外，分別取60只昆蟲置于5，10，15，37，42，47 ℃下各放置1，3，5 h。以無任何處理的試蟲作為對照，各組取出4只速凍于液氮中，再轉(zhuǎn)至-80 ℃超低溫冰箱中，以便RNA的提取和后期相關(guān)的試驗(yàn)。

1.3 試劑

Tag DNA聚合酶、DnaseⅠ、dNTP Mixture、Rnase Inhibitor、Oligo（dT）、Reverse Transcriptase M-mLV（RNase H-）、DNA Marker、 pMD19-T均為大連TaKaRa公司產(chǎn)品。 DNase/RNase-Free ddH2O、SYBR Green Supermix kit 為Invitrogen 公司產(chǎn)品；DEPC為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司產(chǎn)品；Trizol RNA提取試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品；大腸桿菌DH 5α菌株為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，其余所用的化學(xué)試劑（無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇等）均為國產(chǎn)分析純。

1.4 PCR引物的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的家蠶（Bombyx mori）和果蠅（Drosophila melanogaster）以及煙草天蛾（Manduca sexta）的β-actin基因，分析它們的核酸序列同源性，在其保守位點(diǎn)設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增小胸鱉甲（Mp）和光滑鱉甲（Ap）β-actin基因的引物：

Mpβ-actin F 5′-TACTCCGTATGGATCGGTGGATC-3′；

Mpβ-actin R 5′-TTAGAAGCACTTGCGGTGGAC-3′；

Apβ-actin F 5′- GCGACTTGACCGACTACCT -3′；

Apβ-actin R 5′- CCGCACGATTCCATACCC -3′。

1.5 昆蟲總RNA的提取及cDNA的獲得

使用TRIzol法提取昆蟲總RNA。將蟲體置于液氮中研磨至粉末狀，加入到1 mL的Trizol裂解液中，充分振蕩混勻，靜置 10 min后于 4 ℃，12 000 r·min-1，離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移到新離心管，加入200 μL氯仿震蕩混勻，室溫放置5 min后于 4 ℃，12 000 r·min-1，離心15 min。將400～500 μL上清轉(zhuǎn)至新離心管中，然后加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10 min，使核酸沉淀完全（靜置時(shí)有絮狀沉淀物產(chǎn)生），4 ℃，12 000 r·min-1，離心 15 min，棄去上清，然后加入1 mL 70%的乙醇，混勻，4 ℃，12 000 r·min-1，離心5 min，（此步驟重復(fù)2遍）。棄去上清，室溫干燥3 min，然后溶于DEPC處理過的水中，通過紫可見分光光度計(jì)（NanoDrop ND-1000 spectrophotometer）檢測總RNA的濃度和純度。RNA提取后加入 DNA 酶對基因組進(jìn)行消化。反轉(zhuǎn)錄使用MLV反轉(zhuǎn)錄酶、dNTP Mixture、Oligo Dt、 Adaptor PrimerA（TaKaRa公司），用20 uL體系進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)條件為：42 ℃ 60 min；70 ℃ 15 min。反應(yīng)結(jié)束后，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA置于-20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

分別以小胸鱉甲和光滑鱉甲的cDNA為模板，以熒光定量PCR設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增β-actin基因，1%凝膠電泳檢測目的片段的大小，將PCR產(chǎn)物切膠回收后構(gòu)建至pMD19-T 載體上，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Amp抗性的LB平板上，挑取單個白色菌落進(jìn)行培養(yǎng)，堿裂解法制備質(zhì)粒，酶切（EcoR I/Hind III）質(zhì)粒鑒定其正確性，作為制作熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)按照操作說明（帶有ROX的Platinum SYBR GREEN qPCR SuperMix-UDG，Invitrogen公司）進(jìn)行，所用方法為SYBE GREENⅠ的熒光染料法。將cDNA 進(jìn)行5倍稀釋后備用。取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR反應(yīng)，將PCR反應(yīng)的熒光檢測管放入Gene Amp Thermal Cycler 9600中進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。每個樣品重復(fù)2次。采用以下PCR反應(yīng)程序，擴(kuò)增小胸鱉甲β-actin基因的PCR反應(yīng)條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s；45個循環(huán)。每次PCR程序完成后，設(shè)置72 ℃開始檢測產(chǎn)物溶解曲線。記錄Ct值。擴(kuò)增光滑鱉甲β-actin的PCR反應(yīng)條件為：50 ℃，2 min；95 ℃，5 min；95 ℃，15 s，59 ℃，30 s，72 ℃，30 s，45個循環(huán)。每次PCR程序完成后，設(shè)置72 ℃開始檢測產(chǎn)物溶解曲線。記錄Ct值。由于Ct值與利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的拷貝數(shù)的對數(shù)在統(tǒng)計(jì)分析中具有相同的結(jié)果，因此我們直接采用Ct值作為表達(dá)量的計(jì)算指標(biāo)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用醫(yī)學(xué)生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件 GraphPad Prism 4.0 對Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分別對Mpβ-actin 和Apβ-actin在季節(jié)性表達(dá)的相對轉(zhuǎn)錄水平做單因素方差分析。當(dāng)它們的差異顯著時(shí)，則采用多重比較，進(jìn)一步分析它們之間的差異性。對溫度處理的數(shù)據(jù)做兩因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR的溶解曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線

經(jīng)PCR反應(yīng)后，儀器生成β-actin基因擴(kuò)增的溶解曲線，兩組曲線均無雜峰出現(xiàn)（圖1A、B），說明試驗(yàn)過程中無樣品污染和引物二聚體，擴(kuò)增產(chǎn)物單一，可確定為特定的目的片段。由于片段大小不同，小胸鱉甲Mpβ-actin基因的擴(kuò)增片段（120 bp）的熔解峰在82 ℃，而光滑鱉甲Apβ-actin基因擴(kuò)增片段（246 bp）的溶解峰在89 ℃。

將Mpβ-actin和Apβ-actin基因片段的質(zhì)粒作10倍梯度稀釋（101，102，103，104，105，106，107，

109倍）進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測。結(jié)果顯示在101～109范圍內(nèi)，Ct值與Mpβ-actin和Apβ-actin基因有較高的線性關(guān)系（圖1C、D），Mpβ-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.999 1、斜率為-3.324 8、擴(kuò)增效率為99.526%。Apβ-actin標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2=0.999 1、斜率為-3.326 1、擴(kuò)增效率為99.526%。這表明標(biāo)準(zhǔn)曲線可以在較寬的范圍內(nèi)用于Mpβ-actin和Apβ-actin基因的絕對定量。由于基因表達(dá)的絕對定量值是指數(shù)式的，不滿足線性關(guān)系進(jìn)行方差分析，所以在本文的分析中直接采用Ct值作為基因表達(dá)的相對指標(biāo)進(jìn)行各種條件下基因表達(dá)水平的比較。

2.2 小胸鱉甲和光滑鱉甲β-actin基因的季節(jié)性表達(dá)

將不同月份采集的小胸鱉甲和光滑鱉甲成蟲分別用液氮處死后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測β-actin基因的表達(dá)。Ct值結(jié)果顯示小胸鱉甲在5月和8、9月份的Ct值分別為18.02，17.94，17.99（表1），顯著高于其他月份（F7，16=19.02，F(xiàn)0.05（7，16）=2.668 4，P<0.05），表明小胸鱉甲β-actin基因的表達(dá)量隨季節(jié)變化有顯著性差異。不同季節(jié)之間的變異系數(shù)為0.033。而光滑鱉甲的β-actin基因擴(kuò)增的Ct值在不同季節(jié)無顯著性差異（F5，12=0.495，F(xiàn)0.05（5，12）=3.106，P>0.05）（表1）。季節(jié)性表達(dá)水平的變異系數(shù)是0.011 7，小于小胸鱉甲的0.033。

2.3 小胸鱉甲和光滑鱉甲β-actin基因在不同溫差條件下的表達(dá)

荒漠地區(qū)晝夜溫差巨大，在夏季也經(jīng)常達(dá)到30 ℃左右。檢測不同溫度差值對基因表達(dá)的影響是研究荒漠昆蟲環(huán)境適應(yīng)性分子機(jī)制的重要內(nèi)容。通過 10，20，30 ℃ 溫差處理昆蟲后，在兩種昆蟲中β-actin基因的表達(dá)量都呈上升趨勢，但是尚未達(dá)到顯著水平（表 2）。方差分析結(jié)果顯示，小胸鱉甲的F2，6，0.05=2.106，光滑鱉甲的F2，6，0.05=■，F(xiàn)0.05（2，6）=5.143（P>0.05）。

2.4 小胸鱉甲β-actin基因在不同溫度下的表達(dá)

將小胸鱉甲成蟲在不同溫度（5～47 ℃）處理1，3，5 h 后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，記錄Ct值（表3）。對表3中的數(shù)據(jù)進(jìn)行兩因素方差分析，結(jié)果表明，不同溫度處理后，β-actin基因的表達(dá)量有顯著差異（F7，16=3.325，F(xiàn)7，16，0.05=2.889，P<0.05），而同一溫度處理在不同時(shí)間之間，β-actin基因的Ct值無顯著差異（F7，16，0.05=0.226 4，P<0.05）。對不同溫度處理的同一時(shí)間進(jìn)行多重比較，結(jié)果顯示10 ℃ 1 h、15 ℃ 3 h、47 ℃ 5 h 的Ct值都顯著高于同一時(shí)間的其他溫度處理，而37 ℃和42 ℃處理無顯著差異，無論在兩個溫度之間還是不同時(shí)間之間都沒有顯著差異，表明小胸鱉甲β-actin基因?qū)?7 ℃和42 ℃不敏感，而較低的溫度和太高的溫度都影響β-actin基因的表達(dá)。

2.5 光滑鱉甲β-actin基因在不同溫度下的表達(dá)

將光滑鱉甲成蟲在5～47 ℃的不同溫度處理一定時(shí)間后，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，檢測β-actin的表達(dá)，并以Ct值表示（表4）。結(jié)果表明，光滑鱉甲的β-actin在不同溫度條件下的表達(dá)有顯著不同（F5，36=4.817，F(xiàn)5，36，0.01=2.477，P<0.05），但在同一溫度處理的不同時(shí)間之間無顯著差異（F3，36=2.426，F(xiàn)3，36，0.05=3.259，P>0.05）。對不同溫度的相同時(shí)間之間進(jìn)行多重比較可見，只有10 ℃ 1 h、5 h和42 ℃ 1 h的Ct值顯著低于其他處理，表明光滑鱉甲β-actin基因僅在10 ℃和42 ℃處理后表達(dá)水平有差異顯著。

為了在小胸鱉甲和光滑鱉甲之間比較β-actin基因在不同條件下表達(dá)的穩(wěn)定性，采用Ct值的變異系數(shù)進(jìn)行分析。變異系數(shù)是標(biāo)準(zhǔn)差與平均數(shù)的比值，又稱標(biāo)準(zhǔn)差率，反映單位均值上的離散程度。結(jié)果顯示，除了37 ℃之外，光滑鱉甲β-actin基因表達(dá)的變異系數(shù)在不同溫度、不同溫差和季節(jié)性方面都小于小胸鱉甲的β-actin基因的變異系數(shù)（圖2），說明小胸鱉甲β-actin基因的表達(dá)在不同條件下有較大的波動。

3 結(jié)論與討論

荒漠環(huán)境對昆蟲的主要影響是溫度和干旱，由于昆蟲是變溫生物，因此昆蟲對溫度變化的響應(yīng)是其生存適應(yīng)的機(jī)制之一。為了確定今后開展荒漠昆蟲基因表達(dá)研究的內(nèi)參基因，本研究對不同季節(jié)、不同溫差以及不同溫度下兩種昆蟲的β-actin基因表達(dá)的穩(wěn)定性進(jìn)行了比較。研究結(jié)果表明，小胸鱉甲的β-actin基因在不同季節(jié)之間有顯著差異，在不同溫度條件下也有顯著差異，這表明小胸鱉甲β-actin基因的表達(dá)受溫度影響。與上述結(jié)果不一致的是，在本研究所設(shè)的溫差條件下，β-actin基因的表達(dá)無顯著差異，這可能是由于所設(shè)置的溫差是從10 ℃以上開始的，溫度變化程度還不足以引起小胸鱉甲β-actin表達(dá)變化。光滑鱉甲的β-actin基因在不同季節(jié)和溫差處理下無顯著差異，但在不同溫度條件下個別處理（37 ℃，1 h）有顯著升高，該溫度對光滑鱉甲不是脅迫溫度，不應(yīng)該有波動，可能是實(shí)驗(yàn)誤差所致。

季節(jié)變化包括溫度、降水和光照等綜合作用，由于荒漠地區(qū)溫度波動的季節(jié)性很大，所以溫度可能對昆蟲產(chǎn)生主要影響。本研究發(fā)現(xiàn)溫度對小胸鱉甲β-actin基因表達(dá)的影響大于對光滑鱉甲β-actin基因表達(dá)的影響，比較這兩個昆蟲在不同條件下β-actin基因表達(dá)的變異系數(shù)，可以看出，除了37 ℃以外，小胸鱉甲的變異系數(shù)均大于光滑鱉甲。究其原因可能與這兩種昆蟲的生活習(xí)性有關(guān)，小胸鱉甲避光喜陰，白天潛伏在沙土中，可能對溫度變化比較敏感，而光滑鱉甲喜光喜溫，白天在地面上活動，對高低溫的耐受性較強(qiáng)，對溫度變化的敏感性可能較低。某些生物的看家基因經(jīng)高、低溫脅迫后仍然能穩(wěn)定表達(dá)，如對脈胞菌42 ℃處理不同時(shí)間后，tubulin基因的表達(dá)量不隨處理時(shí)間變化[11]?；哪ハx謝氏寬漠王熱激后不同恢復(fù)時(shí)間，其β-actin的表達(dá)量無明顯變化，且與未經(jīng)熱激處理的對照相比無顯著差異[12]，這與光滑鱉甲β-actin基因?qū)囟鹊捻憫?yīng)一致，因此β-actin基因可做為研究光滑鱉甲成蟲在不同溫度條件下的內(nèi)參基因。

看家基因的表達(dá)受溫度影響在其他生物中也有報(bào)道。煙草經(jīng)高溫脅迫后，葉內(nèi)核蛋白基因和β-actin基因的表達(dá)量下降近10%，而擬南芥經(jīng)高溫脅迫后，其葉內(nèi)核蛋白基因和β-actin基因的表達(dá)量下降近50%，并且兩種基因在不同高溫下的表達(dá)量都存在一定程度的差異[13]。溫度對蛋白質(zhì)表達(dá)的影響不僅表現(xiàn)在總蛋白上，也表現(xiàn)在對β-actin、tubulin等看家基因的表達(dá)上[11]。研究表明赤擬谷盜在真菌感染前后β-actin、α-tubulin和RPS6的表達(dá)都發(fā)生了變化[14]。所以，β-actin基因在不同昆蟲體內(nèi)的穩(wěn)定性不同，在具體的試驗(yàn)開始前需要選擇恰當(dāng)?shù)膬?nèi)參，需進(jìn)一步探索在小胸鱉甲體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的基因。

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