林亞秋, 談永萍, 趙燕英, 賀慶華, 羅敏, 邱翔, 鐘紅梅

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大學(xué)學(xué)報編輯部, 四川 成都 610041)

PGC-1α對C2C12成肌細胞增殖的影響

林亞秋1, 談永萍1, 趙燕英1, 賀慶華1, 羅敏2, 邱翔1, 鐘紅梅1

(1.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 四川 成都 610041; 2.西南民族大學(xué)學(xué)報編輯部, 四川 成都 610041)

PGC-1α(Peroxisome Proliferators Activated Receptor gamma coactivator 1 alpha)是一種核受體轉(zhuǎn)錄輔助激活因子,廣泛參與機體的生物氧化和能量代謝活動.本實驗以小鼠C2C12成肌細胞為材料, 通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體, 并且與轉(zhuǎn)染空載體的實驗對照組比較, 利用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效果, 利用MTT比色法檢測PGC-1α對成肌細胞增殖的影響; 結(jié)果顯示, PGC-1α在C2C12成肌細胞中被成功超表達, 在轉(zhuǎn)染后的2 -5 d, 轉(zhuǎn)染真核表達載體組與轉(zhuǎn)染空載體組相比, 顯著抑制細胞增殖(P<0.05), 但在第6 d差異不顯著.

PGC-1α; C2C12成肌細胞; 增殖

骨骼肌是生物體能量代謝的主要場所之一.骨骼肌纖維的類型根據(jù)代謝可分為氧化型和糖酵解型兩種, 不同類型的肌纖維具有不同的特性, 主要表現(xiàn)在其收縮功能、線粒體成分和代謝特性等方面[1], 最終對肉質(zhì)形成具有不同的調(diào)控作用[2].報道指出, 肌肉中氧化型纖維比例高, 肌肉肉色紅潤, 肌內(nèi)脂肪含量高, 肌肉細嫩, 風(fēng)味良好; 反之肌肉中酵解型纖維比例高, 則肉色發(fā)白, 品質(zhì)下降[3-4].肌纖維發(fā)育是一個動態(tài)的過程, 可發(fā)生肌纖維類型轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象, 因此, 從肌纖維類型轉(zhuǎn)化的角度來改變骨骼肌纖維類型組成, 進而改善其品質(zhì)在動物育種領(lǐng)域具有重要的理論與實際意義.

PGC-1α屬于與能量代謝關(guān)系最密切的PGC-1(Peroxisome Proliferators Activated Receptor gamma coactivator 1)轉(zhuǎn)錄輔助活化因子家族成員, 最早由Puigservre于1998年在研究小鼠棕色脂肪組織時所發(fā)現(xiàn)的一種新型核受體轉(zhuǎn)錄輔助激活因子[5].隨后同家族的PGC-1β[6]、PRC[7]也相繼被發(fā)現(xiàn).目前報道指出, PGC-1α廣泛存在于包括哺乳類、鳥類、爬行類和魚類等在內(nèi)的多種脊椎動物中[8].PGC-1α可以輔助激活多種轉(zhuǎn)錄因子, 如核受體家族成員ER、PPARγ[9], 非核受體家族成員SREBP[10], FOXO1[11]及SOX9[12], 廣泛參與調(diào)節(jié)與生物氧化和能量代謝的相關(guān)的過程.PGC-1α具有較明顯的組織表達和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)特異性, 組織表達特異性指該基因主要表達于如心臟、肝臟、骨骼肌等富含線粒體的組織中, 而在白色脂肪組織、小腸、大腸中的表達水平相對較低[13].Lin等2002年發(fā)現(xiàn)PGC-1α可使小鼠的Ⅱ型肌纖維出現(xiàn)Ι型肌纖維的特征[14].此后許多學(xué)者分別采用不同的技術(shù)方法對PGC-1α在人和不同動物(如小鼠和雞等)肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用進行了相關(guān)研究, 指出PGC-1α在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中具有重要的調(diào)控作用, 但是具有物種特異性.關(guān)于PGC-1α在成肌細胞增殖中的作用尚未見報道, 因此本實驗以小鼠C2C12細胞為材料, 通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α質(zhì)粒使其超表達, 研究PGC-1α對成肌細胞增殖的影響, 研究結(jié)果為闡明PGC-1α在肌肉發(fā)育過程中的作用提供重要數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料和主要試劑

本實驗所用小鼠PGC-1α超表達載體—pcDNA3.1-flag-PGC-1α由本實驗室構(gòu)建保存, C2C12成肌細胞由本實驗室凍存?zhèn)溆?

高糖DMEM/F12細胞培養(yǎng)基與胰蛋白酶購自Gibco公司; Sofast 基因轉(zhuǎn)染試劑購自太陽馬公司; 胎牛血清購自杭州四季青公司; Trizol試劑與SYBR Premix Ex Taq II TM購自大連TaKaRa公司; MTT購自Sigma公司; Taq DNA聚合酶與反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自Fermentas公司; 無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒購自AXYGEN公司.

1.2 方法

1.2.1 C2C12成肌細胞的培養(yǎng)

從液氮罐中取出裝有細胞的凍存管, 快速置于37 ℃水浴中, 輕搖1 min使其溶解, 然后加入10倍凍存液體積的培養(yǎng)基, 1050 rpm離心, 4 min, 棄上清, 將細胞接種于含10 %胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS)的高糖DMEM培養(yǎng)基中, 在37 ℃, 5 %CO2的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng). 待細胞將長至90 %以上的時候進行傳代, 接種到96孔和6孔培養(yǎng)板中, 在37 ℃, 5 %的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染

將實驗室已有的pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中重新活化并擴大培養(yǎng), 經(jīng)上海生工有限公司測序鑒定正確后按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒待用于轉(zhuǎn)染.

待細胞密度在90 %左右開始進行轉(zhuǎn)染, 轉(zhuǎn)染前對細胞進行饑餓處理, 于2 h 前換一半無血清無雙抗的DMEM培養(yǎng)基.然后按照Sofast轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作轉(zhuǎn)染到6孔和96孔培養(yǎng)板中.

1.2.3 轉(zhuǎn)染效果的檢測

收集轉(zhuǎn)染后第2 d的C2C12成肌細胞, 然后用Trizol試劑提取收集的細胞總RNA, 利用瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取RNA的完整性, 利用紫外分光光度計測定提取總RNA的OD值.取鑒定好的1 μg總RNA以O(shè)ligo (dT)為引物合成cDNA第一鏈.利用Primer Premier5.0軟件, 設(shè)計PGC-1α和β-actin基因特異引物(表1), 然后利用熒光定量PCR檢測PGC-1α的超表達效果.熒光定量PCR反應(yīng)體系如下: SYBR Premix Ex Taq II TM PCR 10 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL, cDNA 1μL, 最后加滅菌水至20 μL.反應(yīng)條件為: 95 °C預(yù)變性1 min, 95 °C變性30 s, 退火30 s(56.8 ℃/60 ℃), 45個循環(huán), 72°C 延伸30 s.所獲得的熒光定量數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法進行分析[15].

1.2.4 MTT比色

分別對轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體和空載體組的2-6 d的細胞進行MTT比色測定.在測定前四個4 h, 于96孔培養(yǎng)板中加入20 μL MTT溶液, 4 h后終止培養(yǎng).棄去培養(yǎng)液后, 每孔加入150 μL DMSO, 恒溫搖床上震蕩10 min, 選擇波長490 nm, 在酶聯(lián)檢測儀上測定各孔的吸光度值.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用生物統(tǒng)計軟件SPSS 13.0進行分析, 數(shù)據(jù)用平均值±標準誤( mean±SE) 表示, 顯著性檢驗分析采用ANOVA進行, 差異顯著P<0.05, 差異極顯著P<0.01.

表1 基因特異引物序列Table 1 Primers for specific genes

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α后PGC-1α表達的變化

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體后的C2C12細胞, 提取第2天細胞總RNA, 經(jīng)過熒光定量PCR檢測PGC-1α mRNA 的表達水平, 如圖1所示, 轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體組PGC-1α mRNA 的表達水平極顯著高于轉(zhuǎn)染空載體組.證明我們轉(zhuǎn)染的pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體使細胞中PGC-1α的表達水平升高.

圖1 熒光定量PCR分析轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α后PGC-1α表達的變化Fig.1 Real-time fluorescence quantitative PCR analysis of PGC-1α in C2C12 myoblast transfected with pcDNA3.1-flag-PGC-1α

2.2 pcDNA3.1-flag-PGC-1α對C2C12細胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體后的C2C12細胞, 用含10 %FBS的高糖DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng), 在轉(zhuǎn)染后的第2-6 d分別用MTT比色法處理細胞.由結(jié)果可知(圖2), 在轉(zhuǎn)染后的第2-5 d, 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體組與轉(zhuǎn)染空載體組相比, 顯著抑制細胞增殖, 但在第6 d差異不顯著, 原因可能是在第6 d已經(jīng)無超表達效果.

圖2 PGC-1α對C2C12細胞增殖的影響Fig.2 The effect of PGC-1α on C2C12 cell proliferation

3 討論

肌纖維是肌肉組織的基本組織單位, 其形成是一個復(fù)雜的過程, 其中成肌細胞分化是肌纖維發(fā)生中的關(guān)鍵一步, 因此研究成肌細胞增殖和分化具有重要的理論和實際意義.PGC-1α作為轉(zhuǎn)錄輔助活化因子在機體能量代謝中發(fā)揮重要作用[16].近幾年關(guān)于PGC-1α在骨骼肌中的作用, 尤其是在肌纖維類型轉(zhuǎn)化中的作用成為學(xué)者研究的焦點問題.Yamaguchi等指出, 在連續(xù)的溫和熱應(yīng)激下PGC-1α可使人成肌細胞中Ⅱ型肌纖維向Ⅰ型肌纖維轉(zhuǎn)化[17]; Nikoli?等指出通過向體外培養(yǎng)的人成肌細胞中轉(zhuǎn)染PGC-1α逆轉(zhuǎn)錄病毒載體使PGC-1α超表達, 發(fā)現(xiàn)Ⅱa型肌纖維的標志基因MyHCⅡa mRNA表達水平被顯著降低, MyHCI/MyHCⅡa mRNA比率被顯著增加[18].Ueda等研究指出, 溫度刺激PGC-1α表達后可使雞胸肌部分Ⅱb型轉(zhuǎn)化為Ⅱa型肌纖維[19].本實驗室前期研究結(jié)果表明PGC-1α在C2C120-8 d均存在表達, 在第4 d和第6 d表達水平最高, 且通過生肌抑制素MyoG的表達來促進C2C12細胞的分化[20].但關(guān)于PGC-1α對C2C12細胞增殖的作用如何尚未見報道, 為了確定其是否在增殖的過程中發(fā)揮作用, 本實驗通過轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體, 使PGC-1α基因超表達, 然后利用MTT比色法檢測了其對成肌細胞增殖的影響.結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后的第2-5 d, 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-flag-PGC-1α真核表達載體組與轉(zhuǎn)染空載體組相比, 顯著抑制成肌細胞增殖, 但其作用機理尚需要進行深入研究.

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Influence of PGC-1α on C2C12 myoblast proliferation

LIN Ya-qiu1, TAN Yong-ping1, ZHAO Yan-ying1, HE Qing-hua1, LUO Min2, QIU Xiang1, ZHONG Hong-mei1
(1.School of Life Science and Technology, Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.; 2.Journal of Southwest University for Nationalities, Chengdu 610041, P.R.C.)

Peroxisome proliferator-activated receptor co-activator 1α (PGC-1α) is a functional activator of peroxisome proliferator-activated receptor, involved in biological oxidation and energy homeostasis.In the present study, a plasmid pcDNA3.1-flag-PGC-1α was constructed and transfected into C2C12 cells.PGC-1α over-expressions were detected using real-time quantitative PCR.Furthermore, the influence of PGC-1α on C2C12 cell viability was examined by MTT.The results showed that PGC-1α was over-expressed in C2C12 cells, the cell proliferation was significantly inhibited in PGC-1α transfection groups versus control groups (empty vector transfection) in the 2ndto 5thdays after transfection (P<0.05).However, the inhibition effect was not significant on the 6thday.

PGC-1α; C2C12 myoblast; proliferation

Q591

A

1003-4271(2014)06-0814-04

10.3969/j.issn.1003-4271.2014.06.03

2014-09-19

林亞秋(1976-), 女, 漢族, 內(nèi)蒙古阿榮旗人, 副教授, 博士.

國家自然科學(xué)基金(No.31201990)和四川省應(yīng)用基礎(chǔ)項目(2014JY0088)