陳娟，王治業(yè)*，魏甲乾，祁宏山，季彬，曾楊，周劍平，王鳴剛

（1.甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000；2.蘭州理工大學生命科學學院，甘肅蘭州730050；3.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅蘭州730000）

多菌種分步固態(tài)發(fā)酵果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝優(yōu)化

陳娟1，3，王治業(yè)1，3*，魏甲乾1，3，祁宏山1，3，季彬1，3，曾楊1，3，周劍平3，王鳴剛2

（1.甘肅省科學院生物研究所，甘肅蘭州730000；2.蘭州理工大學生命科學學院，甘肅蘭州730050；3.甘肅省微生物資源開發(fā)利用重點實驗室，甘肅蘭州730000）

實驗研究了多菌種分步固態(tài)發(fā)酵果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝條件，以果渣為主要原料，麩皮、豆粕、谷糠等為輔料，通過對多菌種（黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母和釀酒酵母）接種及培養(yǎng)方法、菌液的接種量、發(fā)酵的最佳溫度、共發(fā)酵時間、固液比及物料酸堿度因素的優(yōu)化研究，獲得了優(yōu)化后的多菌種分步固態(tài)發(fā)酵果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料生產(chǎn)工藝。通過單因素試驗及正交試驗，確定最佳發(fā)酵條件為固液比60%，初始pH5.5，溫度30℃，黑曲霉的接種量為7.50%，復合酵母液的接種量為10%，黑曲霉在發(fā)酵初期接入，復合酵母液在發(fā)酵24h后接入，共培養(yǎng)時間為72h。在最佳菌種配比和發(fā)酵條件下，發(fā)酵終產(chǎn)物的粗蛋白質(zhì)含量從4.97%增加至27.60%，增長了22.63個百分點，達到優(yōu)質(zhì)蛋白飼料標準。

果渣；分步發(fā)酵；蛋白飼料；工藝；多菌種

我國是一個農(nóng)業(yè)大國，每年可產(chǎn)果渣約1 000萬t[1-3]，除少量被直接利用外[2]，絕大部分由于含水量過大、蛋白質(zhì)低等原因無法直接作為畜禽飼料而被遺棄，造成了嚴重的環(huán)境污染[4-5]。近幾年來，隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，蛋白質(zhì)飼料的需求量與日俱增，因此探索如何將果渣轉(zhuǎn)化為動物可以利用的營養(yǎng)價值高的蛋白飼料是一個值得研究的課題。

用果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的報道很多，但對于分步固態(tài)發(fā)酵果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的報道較少。糖化、發(fā)酵過程分開進行能使發(fā)酵產(chǎn)物蛋白質(zhì)含量更高，因此該試驗以果渣為主要原料，麩皮、豆粕和谷糠為輔料，利用多菌種（黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母和釀酒酵母）進行分步固態(tài)發(fā)酵。通過單因素試驗和正交試驗設計對其接種及培養(yǎng)方法、菌液的接種量、發(fā)酵的最佳溫度、共發(fā)酵時間、固液比及物料酸堿度因素的優(yōu)化研究，以確定菌體蛋白飼料的最佳發(fā)酵生產(chǎn)工藝，欲在菌種搭配選擇及多分步發(fā)酵上為蘋果渣利用提供一種新途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、熱帶假絲酵母、釀酒酵母：由中國工業(yè)微生物菌種保藏中心甘肅分中心提供。

黑曲霉斜面培養(yǎng)基采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[6-8]；酵母斜面培養(yǎng)基：麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基[9-10]；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮/豆粕/果渣/谷糠=1∶1∶7∶1。

麩皮、豆粕、果渣、谷糠均由甘肅帝旺生物科技有限責任公司提供。

發(fā)酵前測定原料中粗蛋白質(zhì)的含量為4.97%。

PDA培養(yǎng)基：土豆（去皮）200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，蒸餾水1L。

麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：12°Bx麥芽汁1.0L，瓊脂15.0g。1.2儀器與設備

AS型干燥箱：北京科偉永興儀器有限公司；LBH-300T多功能粉碎機：永康科徠爾有限公司；SKY-100C恒溫搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；島津UV-120-02紫外可見分光光度計：杭州庫侖科技有限公司；MJ-150Ⅱ培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；ZRN-PH-D型臺式pH計：北京中瑞能儀表技術(shù)有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑曲霉種子接種量確定

以不同接種量的黑曲霉種子接種進行混合固態(tài)發(fā)酵，比較發(fā)酵后酸性蛋白酶活性，確定最佳接種量。

1.3.2 復合酵母液及其接種量優(yōu)化

在固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，以不同接種量的復合酵母菌種液接種進行混合固態(tài)發(fā)酵，比較發(fā)酵后的粗蛋白質(zhì)含量，確定最佳接種量?；旌辖湍妇N液為產(chǎn)朊假絲酵母/熱帶假絲酵母/釀酒酵母=1∶1∶1。

1.3.3 接種及培養(yǎng)方法的確定

由于本試驗采用多菌種分步發(fā)酵，因此對于菌種的接種次序及培養(yǎng)方法采用以下3種不同的方案進行比較，如表1所示。

表1 接種及培養(yǎng)方法Table 1 Inoculation and cultivation methods

1.4 固態(tài)發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化

1.4.1 發(fā)酵溫度的選取

按先接種黑曲霉菌液7.5%、24h后接種10%的混合酵母菌液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別在24℃、27℃、30℃、33℃和36℃培養(yǎng)，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)的含量。

1.4.2 最佳共發(fā)酵時間的確定

在確定的最佳溫度條件下，按先接種黑曲霉菌液7.5%、24h后接種10%的混合酵母菌液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，每24h測定1次粗蛋白質(zhì)含量，確定最佳共發(fā)酵時間。

1.4.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比的確定

在確定以上兩步試驗的基礎(chǔ)上進行發(fā)酵試驗，按先接種黑曲霉菌液7.5%、24h后接種10%的混合酵母菌液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別按50%、60%、70%的固液比進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)的含量。

1.4.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值的選取

在以上三步試驗的基礎(chǔ)上進行發(fā)酵試驗，按先接種黑曲霉菌液7.5%、24h后接種10%的混合酵母菌液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別按初始pH值為5.5、6.0、6.5進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后分別測定發(fā)酵產(chǎn)物中的粗蛋白質(zhì)的含量。

1.4.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗

采用4因素3水平正交試驗設計方案，4個試驗因素分別為發(fā)酵溫度（A）、共發(fā)酵時間（B）、固液比（C）和初始pH值（D），原料經(jīng)121℃滅菌，按先接種黑曲霉菌液7.5%、24h后接種10%的混合酵母菌液于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中。發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗因素水平見表2。

表2 固態(tài)發(fā)酵條件的正交試驗設計的因素和水平Table 2 Factors and levels of orthogonal test for solid state fermentation

1.5 測定指標

粗蛋白含量的測定：采用微量凱氏定氮法測定樣品的含氮量。

酸性蛋白酶活性測定：采用Folin酚法，在一定pH值（pH3.6或7.0）和40℃溫度條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸定義為一個蛋白酶活力單位，以每克固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物所含酶活力單位表示發(fā)酵單位，U/g[14-15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量的確定

2.1.1 黑曲霉種子接種量確定

表3 黑曲霉接種量對發(fā)酵結(jié)果的影響Table 3 Effect ofAspergillus nigerinoculation on fermentation results

由表3可見，接種量為7.50%時，酸性蛋白酶活最高，因此7.50%為黑曲霉種子的最佳接種量。

2.1.2 復合酵母液及其接種量優(yōu)化

從圖1可以看出，當復合酵母液接種量低于10%時，發(fā)酵物中粗蛋白的含量隨接種量的增加而增加；當接種量高于10%時，發(fā)酵物中粗蛋白的含量隨接種量的增加而呈下降趨勢，故復合酵母液適宜的接種量為10%。若接種量過低，發(fā)酵產(chǎn)物中的菌種數(shù)量過少，從而獲得的粗蛋白含量也過少；當接種量過高時，發(fā)酵物中的菌種數(shù)量過多，營養(yǎng)物質(zhì)很快被消耗，并釋放大量的熱能，容易導致溫度過高使菌體失活，從而粗蛋白含量減少。

圖1 不同的復合酵母液接種量對粗蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different compound yeast inoculum on crude protein content

2.2 接種及培養(yǎng)方法的確定

表4 不同接種方法發(fā)酵果渣產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量比較Table 4 Comparison of crude protein content of fruit residue products fermented by different inoculation method

由表4可見，采用方法3——先接種黑曲霉，24h后接種復合酵母液，此時發(fā)酵后的產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量增幅最大。由此表明，分階段發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量高于同時發(fā)酵。多菌種的作用并不是簡單的加和效應，糖化、發(fā)酵過程分開進行能使發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白質(zhì)含量更高。黑曲霉具有多種活性較強的酶系，如淀粉酶、酸性蛋白酶等，可將原料中的纖維素等大分子化合物降解轉(zhuǎn)化為動物易消化利用的養(yǎng)分，也為微生物提供能量來源。酵母菌是菌體蛋白的主要生產(chǎn)菌種。因此粗蛋白質(zhì)含量的提高是黑曲霉和復合酵母共同作用的結(jié)果。

2.3 固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.3.1 最佳發(fā)酵溫度的選擇

從圖2可以看出，起初粗蛋白質(zhì)的含量隨著溫度的升高而逐漸上升，在培養(yǎng)溫度為30℃時，粗蛋白質(zhì)含量最高，可達25.94%；之后隨著溫度的升高，粗蛋白質(zhì)含量反而下降。溫度是發(fā)酵過程中影響微生物生長繁殖最重要的因素之一。溫度過低，會抑制微生物的生長，并阻礙其他的生物化學反應；溫度過高，則會影響菌體孢子的萌發(fā)、生長及產(chǎn)物的形成。每種微生物都有其最佳的生長溫度，因此，選擇30℃為發(fā)酵的最佳培養(yǎng)溫度。

圖2 不同的溫度對粗蛋白含量的影響Fig.2 Effect of different temperature on crude protein content

2.3.2 共發(fā)酵時間的確定

圖3 不同的發(fā)酵時間對粗蛋白含量的影響Fig.3 Effect of different fermentation time on crude protein content

從圖3可以看出，起初粗蛋白含量隨發(fā)酵時間的增加而升高，發(fā)酵72h時粗蛋白含量達到最高，而隨著發(fā)酵時間繼續(xù)延長，粗蛋白含量則會隨發(fā)酵時間的延長而下降。發(fā)酵時間是決定發(fā)酵是否結(jié)束的定時點。發(fā)酵時間過短，菌體不能充分生長，會導致發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白質(zhì)含量過低；發(fā)酵時間過長，發(fā)酵進入了衰退期，粗蛋白質(zhì)含量的增幅減緩，甚至出現(xiàn)下降，且生產(chǎn)成本也增加。共發(fā)酵的最佳周期為72h。

2.3.3 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比的確定

固液比的控制在飼料發(fā)酵過程中非常重要，固液比過低，會延緩甚至阻礙菌體的生長繁殖、產(chǎn)酶；固液比過高時，導致物料多孔性降低，空氣流通不暢，供氧不足，內(nèi)部微生物難于生長。在固體發(fā)酵過程中適宜的固液比，使得基質(zhì)有合適的疏松度，顆粒間膨松有空隙，有助于菌體從基質(zhì)獲得營養(yǎng)物質(zhì)和氧的傳遞，從而促進生長繁殖和產(chǎn)物的合成。從圖4可以看出，固液比為60%時粗蛋白質(zhì)的含量最大，因此選擇固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的固液比為60%。

圖4 不同的固液比對粗蛋白含量的影響Fig.4 Effect of different solid-liquid ratio on crude protein content

2.3.4 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值的選取

對于黑曲霉和酵母的混合發(fā)酵，在合適的pH值范圍生長時蛋白質(zhì)產(chǎn)量可達最高。如圖5所示，在初始pH值為6.0時發(fā)酵效果最好，因此固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳初始pH值為6.0。

圖5 不同的初始pH值對粗蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different initial pH on crude protein content

2.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果

各因素對發(fā)酵原料中的粗蛋白質(zhì)含量的影響正交試驗見表5，驗證試驗見表6，方差分析見表7。

從正交試驗結(jié)果極差（R）分析可看出，4個因素對發(fā)酵原料中的粗蛋白質(zhì)含量的影響次序依次為A>B>D>C。即各因素中發(fā)酵溫度對粗蛋白質(zhì)含量的影響最大。最佳組合為A1B2C2D1，但該組合不在9次試驗內(nèi)，而表觀最佳組合為A1B2C2D2，為驗證正交試驗結(jié)果，按正交最佳組合和表觀最佳組合的配方進行驗證試驗，結(jié)果見表6。

表5 固態(tài)發(fā)酵條件的正交試驗結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test for solid-state fermentation condition

表6 正交試驗驗證試驗Table 6 Verification test of orthogonal experiment

從表6可見，按正交最佳組合進行發(fā)酵所產(chǎn)生的粗蛋白質(zhì)含量最高。因而綜合單因素試驗和正交試驗結(jié)果可見，多菌種分步固態(tài)發(fā)酵果渣的最佳發(fā)酵條件為A1B2C2D1，即培養(yǎng)溫度30℃，共培養(yǎng)時間72h，固液比60%，初始pH值5.5。此時，發(fā)酵得到的粗蛋白質(zhì)含量最高，可達27.60%，比發(fā)酵前提高了22.63個百分點，達到蛋白飼料對蛋白質(zhì)含量的要求。

表7 正交試驗結(jié)果方差分析Table 7 Variance analysis of orthogonal experiment result

由于無空列和重復試驗，因此將極差分析結(jié)果中最次要的因素C作為空列，進行方差分析。方差分析結(jié)果由表7可見，因素A極顯著，因素B顯著，因素D不顯著，因素作用的主次順序為A>B>D，與極差分析得出的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

3.1 發(fā)酵前后，粗蛋白質(zhì)的含量變化較大。所有試驗組粗蛋白含量均增加，最大增長了22.63個百分點。

3.2 試驗結(jié)果表明，多菌種分步固態(tài)發(fā)酵果渣的最佳接種及培養(yǎng)方式為先接種黑曲霉菌液7.50%，24h后接種10%的復合酵母液。

3.3 通過對培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究，得到最佳的發(fā)酵條件：培養(yǎng)溫度30℃，共培養(yǎng)時間72h，固液比為60%，初始pH值為5.5。

3.4 多菌種分步固態(tài)發(fā)酵果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝發(fā)酵時間短、污染少、蛋白質(zhì)含量高，具有一定的可行性、實用性，可廣泛地應用于以果渣為基質(zhì)的蛋白飼料的發(fā)酵生產(chǎn)，這種工藝為果渣利用提供了一種新途徑。

[1]陳松，丁立孝，張莉，等.發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)蛋白飼料的混合菌種的篩選[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2008，242（2）：94-96.

[2]武運，李煥榮，陶詠霞，等.發(fā)酵蘋果渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料工藝的研究[J].中國釀造，2009，28（1）：83-86.

[3]劉勇，龔月生，劉林麗.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白飼料的研究[J].中國飼料，2006（13）：38-40.

[4]喬君毅，張福元.混菌固態(tài)發(fā)酵豆渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料生產(chǎn)工藝的研究[J].飼料工業(yè)，2008，29（22）：21-24.

[5]鄧桂蘭，魏強華.利用茶粕生產(chǎn)菌體蛋白飼料的研究[J].糧食與食品工業(yè)，2008（3）：31-38.

[6]鐘世博，趙建國，朱中原.混種固態(tài)發(fā)酵大曲酒糟生產(chǎn)蛋白飼料研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2000（11）：23-25.

[7]劉漢文，姜官鑫，封功能，等.玉米芯固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的工藝研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2010（5）：32-35.

[8]楊希娟，孫小風，肖明，等.馬鈴薯渣生產(chǎn)菌體蛋白飼料的工藝條件優(yōu)化[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2009，176（6）：41-44.

[9]何勇錦，謝碧峰.生料發(fā)酵制備新型蛋白飼料工藝研究[J].飼料博覽，2009（10）：33-38.

[10]劉超，李學如，柳樂，等.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)新型蛋白飼料工藝研究[J].糧食與飼料工業(yè)，2006（9）：29-31.

[11]吳萍，李正鵬，饒圣宏，等.利用廢菌渣生產(chǎn)單細胞蛋白飼料研究[J].中國飼料，2008（22）：38-41.

[12]陳合，余建軍，舒國偉，等.多菌種分步降解玉米秸稈生產(chǎn)蛋白飼料的工藝[J].農(nóng)業(yè)工程學報，2009，25（12）：331-334.

[13]胡銀川，李明元，林國秀，等.蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料的混合菌配比研究[J].西華大學學報：自然科學版，2010，29（4）：110-112.

[14]劉穩(wěn)結(jié)，王際輝，葉淑紅，等.高蛋白豆粕飼料發(fā)酵條件研究[J].中國釀造，2010，29（2）：127-130.

[15]楊旭，蔡國林，曹鈺，等.固態(tài)發(fā)酵提高豆粕含量的條件優(yōu)化研究[J].中國釀造，2008，27（5）：17-20.

Technology optimization of multi-strains multi-step solid-state fermentation of fruit residue to produce cell protein feeds

CHEN Juan1,3,WANG Zhiye1,3*,WEI Jiaqian1,3,QI Hongshan1,3,JI Bin1,3,ZENG Yang1,3,ZHOU Jianping3,WANG Minggang2
(1.Gansu Provincial Academy of Sciences Institute of biology,Lanzhou 730070,China; 2.School of Life Sciences,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China; 3.Key Laboratory of Gansu Province,resource development and utilization of microorganisms,Gansu Lanzhou 730000)

The condition of multi-strains multi-step solid-state fermentation of fruit residue to produce cell protein feeds was studied.Taking fruit residue as the main raw material,bran,soybean meal,carvings and others as accessories,through the study on multi-strains(Aspergillus niger,Candida utilis,Candida tropicalisandSaccharomyces cerevisiae)inoculation and cultivation methods,inoculum,optimum temperature for fermentation, co-fermentation time,solid-liquid ratio and material pH,the optimized multi-strains multi-step solid-state fermentation of fruit residue to produce cell protein feeds production process was obtained.By single factor test and orthogonal test,the optimum fermentation conditions were obtained as follows:material quality/water volume 60%,initial pH 5.5,temperature 30℃,inoculum ofAspergillus niger7.50%,inoculums of compound 10%,A.nigerwas inoculated in the early stage of fermentation,compound liquid yeast was inoculated after fermentation for 24h,co-fermentation time 72h. Under the optimized condition,the crude protein in end product increased from 4.97%to 27.6%,increased by 22.63%,which achieved the high quality protein feed standard.

fruit residue;multi-step fermentation;protein feeds;technology;multi-strains

TQ920.9

A

0254-5071（2014）03-0040-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.011

2014-01-13

甘肅省科技支撐計劃（1204JKCA190）；甘肅省自然基金（096RJZA023）

陳娟（1983-），女，研實員，本科，研究方向為廢棄資源綜合利用及微生物發(fā)酵。

*通訊作者：王治業(yè)（1976-），男，高級工程師，碩士，研究方向為生物工程。