鮑帥帥，張默，王新平，陳雄，陳守文，李俊輝，李冬生，王志*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北武漢430068；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)綠康生物工程研究所，湖北武漢430070；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

谷氨酸對(duì)地衣芽孢桿菌產(chǎn)桿菌肽的影響

鮑帥帥1，張默1，王新平1，陳雄1，陳守文2，李俊輝3，李冬生1，王志1*

（1.湖北工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，湖北武漢430068；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)綠康生物工程研究所，湖北武漢430070；3.綠康生化股份有限公司，福建浦城353400）

研究了發(fā)酵過(guò)程中添加谷氨酸對(duì)菌體代謝和桿菌肽合成的影響。搖瓶發(fā)酵過(guò)程中添加0.03g/L谷氨酸，桿菌肽產(chǎn)量增加13.4%，而10L發(fā)酵罐發(fā)酵16h添加0.03g/L谷氨酸，桿菌肽效價(jià)在36h達(dá)到峰值。發(fā)酵16～26h以3mg/（L·h）流加谷氨酸，桿菌肽16～34h的合成速率是34.0U/（mL·h），比對(duì)照組提高55.3%；同時(shí)，生物量16～30h增長(zhǎng)速率是20.2μg/（mL·h），比對(duì)照組提高了17.4%，但是菌體自溶時(shí)間比對(duì)照提前了6h。NO2-濃度在18～32h高于對(duì)照組11.4%～154.9%，揮發(fā)性脂肪酸（VFA）濃度在22～32h低于對(duì)照組10.3%～94.8%。說(shuō)明流加谷氨酸起到了調(diào)控因子的作用，通過(guò)生成NO2-增加了NADH的消耗，降低了VFA的生成，刺激了菌體在發(fā)酵中前期的生長(zhǎng)；谷氨酸同時(shí)也參與到了桿菌肽的合成，加快了桿菌肽的積累。

地衣芽孢桿菌；桿菌肽；谷氨酸；生長(zhǎng)因子；合成前體

桿菌肽是由一些地衣芽胞桿菌和枯草芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的多肽類抗生素，并被國(guó)內(nèi)外廣泛用作飼料添加劑[1]。桿菌肽分子是由谷氨酸、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸等12個(gè)氨基酸組成的含有噻唑環(huán)的多肽復(fù)合體[2]。因此，氨基酸的代謝在桿菌肽的生物合成中起著重要作用，如Lys、Asn、Phe、Ile、Leu、Asp、Cys等對(duì)生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用[3]。而谷氨酸、谷氨酰胺又是細(xì)胞氮代謝的重要中轉(zhuǎn)站，發(fā)酵過(guò)程中添加的外源谷氨酸，可以促進(jìn)鳥(niǎo)氨酸等氨基酸的合成過(guò)程[4]、增加谷氨酰胺供量以增加細(xì)胞代謝所需氮的供給[5]以及為桿菌肽合成提供前體[6]。

另外，由于地衣芽孢桿菌濁液發(fā)酵產(chǎn)桿菌肽細(xì)胞濃度高、發(fā)酵液黏稠，造成了細(xì)菌在發(fā)酵中后期處于缺氧的環(huán)境[7]。而地衣芽孢桿菌是典型的兼性厭氧菌，細(xì)胞為了平衡NADH/NAD+，可通過(guò)生成丙酸、丁酸等揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）[8]來(lái)消耗NADH。另外，地衣芽孢桿菌具有同化型硝酸鹽還原系統(tǒng)（將NO3-還原生成NO2-并生成NH4+）[9]，可以通過(guò)硝酸鹽呼吸消耗NADH[10]。VFA和NO2-的濃度變化可以反映細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)研究了谷氨酸的添加對(duì)氧限制條件下地衣芽孢桿菌生長(zhǎng)、代謝以及桿菌肽合成的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 培養(yǎng)基

（1）種子斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g/L，牛肉提取物3g/L，酵母抽提物2g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15g/L，37℃培養(yǎng)24h。

（2）發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粉50g/L，淀粉40g/L，碳酸鈣4g/L，硫酸銨0.7g/L，蛋白胨10g/L。

1.1.2 菌種來(lái)源

地衣芽孢桿菌LC-11（Bacillus licheniformisLC-11）由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)綠康生物工程研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

SPX-150D型恒溫生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；UV-722型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器總廠；TGL-20臺(tái)式高速離心機(jī)：武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展有限責(zé)任公司；1200高效液相色譜：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

10L罐培養(yǎng)：裝料5L，接種量10%（v/v），空氣流量600L/h，轉(zhuǎn)速300r/min，37℃培養(yǎng)42h左右。

1.3.2 樣品處理方法

發(fā)酵過(guò)程中，周期取10mL發(fā)酵液，液氮凍存。解凍后在10 000r/min、4℃條件下離心30min，上清液用于代謝物檢測(cè)。

1.3.3 桿菌肽的檢測(cè)

取預(yù)處理后的上清液1mL，加入體積分?jǐn)?shù)50%乙醇4mL，振蕩3min搖勻，再10 000r/min離心5min，取上清液0.22μm過(guò)濾，濾液用于高效液相色譜法檢測(cè)桿菌肽的含量[11]。

1.3.4 NO2-的測(cè)定方法

在弱酸條件下，亞硝酸根離子與對(duì)氨基苯磺酸重氮化合物反應(yīng)，產(chǎn)物與鹽酸萘乙二胺偶合生成紫紅色的重氮化合物，采用分光光度法測(cè)定NO2-的濃度[12]。

1.3.5 生物量的測(cè)定

采用二苯胺法測(cè)定培養(yǎng)液中DNA的含量[13]，用DNA的含量表征生物量。

1.3.6 VFA的測(cè)定方法

揮發(fā)性脂肪酸與乙二醇在加熱條件下反應(yīng)生成酯，生成的酯再與羥胺反應(yīng)生成氧肟酸，在高鐵試劑存在的條件下氧肟酸與高鐵離子反應(yīng)形成棕紅色的絡(luò)合物。利用此顏色反應(yīng)可以測(cè)定揮發(fā)酸的含量[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)20h添加谷氨酸對(duì)桿菌肽合成的影響

圖1 搖瓶培養(yǎng)20h添加谷氨酸對(duì)桿菌肽效價(jià)的影響Fig.1 Effect of glutamic acid addition at 20h on bacitracin production in shake flasks

在搖瓶發(fā)酵20h時(shí)分別添加終濃度0.01g/L、0.03g/L、0.05g/L、0.07g/L的谷氨酸，發(fā)酵48h后檢測(cè)發(fā)酵液的效價(jià)如圖1所示。添加不同濃度的谷氨酸都對(duì)桿菌肽的合成起到了促進(jìn)作用，谷氨酸添加量為0.03g/L時(shí)桿菌肽效價(jià)達(dá)到759U/mL，比對(duì)照提高了13.4%，說(shuō)明適量添加谷氨酸能夠有效提高地衣芽孢桿菌產(chǎn)桿菌肽的效率。

2.2 10L罐發(fā)酵16h添加谷氨酸（0.03g/L）對(duì)生長(zhǎng)和桿菌肽合成的影響

圖2 10L罐培養(yǎng)16h添加0.03g/L谷氨酸對(duì)桿菌肽產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of glutamic acid addition(0.03g/L)on bacitracin production in a 10L bioreactor cultivated for 16h

由于桿菌肽在搖瓶和發(fā)酵罐發(fā)酵的周期不同，通過(guò)搖瓶發(fā)酵的添加時(shí)間占總發(fā)酵時(shí)間的比例換算（搖瓶添加時(shí)間×發(fā)酵罐發(fā)酵總時(shí)間/搖瓶發(fā)酵時(shí)間）確定在16h向罐中補(bǔ)加谷氨酸。如圖2所示：添加組桿菌肽效價(jià)在發(fā)酵36h達(dá)到最大856U/mL，并且隨時(shí)間延長(zhǎng)生物量（以DNA含量表示）開(kāi)始減少；而對(duì)照組效價(jià)38h達(dá)到最大值923U/mL，且生物量開(kāi)始減少。雖然發(fā)酵效價(jià)達(dá)到最高峰的時(shí)間縮短了2h，但是添加組桿菌肽效價(jià)卻較對(duì)照降低了7.3%。而且添加對(duì)細(xì)胞的后期生物量產(chǎn)生了抑制作用，其生物量在34～38h低于對(duì)照2.8%～30.9%，而且38h開(kāi)始急劇下降，40h比對(duì)照降低了30.9%。說(shuō)明一次性添加谷氨酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和代謝干擾大，后期生物量明顯低于對(duì)照，而且菌體自溶時(shí)間比對(duì)照提前了2h。因此，采用連續(xù)流加的方式考察谷氨酸對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝和桿菌肽合成的影響。

2.3 10L罐16h流加谷氨酸對(duì)桿菌肽合成的影響

圖3 10L罐培養(yǎng)16～26h過(guò)程中以3mg/（L·h）的速率流加谷氨酸對(duì)桿菌肽產(chǎn)量和生物量的影響Fig.3 Effect of glutamic acid addition from 16h to 26h at the rate of 3mg/（L·h）on bacitracin production and biomass in a 10L bioreactor

由圖3可知，從16h開(kāi)始以3mg/（L·h）速率流加谷氨酸（總量不變，流加10h），桿菌肽的合成速率（16～34h）是34.0U/（mL·h），比對(duì)照21.9U/（mL·h）顯著提高55.3%，效價(jià)高點(diǎn)（34h）比對(duì)照（38h）提前了4h。添加組生物量的增長(zhǎng)速率（16～30h）是20.2μg/（mL·h），比對(duì)照組的17.2μg/（mL·h）提高了17.4%，并在30h開(kāi)始自溶，比對(duì)照提前了6h。說(shuō)明流加的谷氨酸既刺激了菌體在發(fā)酵中前期的生長(zhǎng)，也參與到了桿菌肽的合成，加快了桿菌肽的積累，且桿菌肽效價(jià)到了1 020U/mL，比對(duì)照提高9.6%。

2.4 10L罐發(fā)酵過(guò)程VFA和NO2-的變化規(guī)律

圖4 10L罐培養(yǎng)過(guò)程中以0.3mg/（L·h）的速率流加谷氨酸10h對(duì)VFA和NO2-(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)的影響Fig.4 Effect of training process with glutamic acid addition rate of 0.3mg/（L·h）for 10h on VFA and NO2-with standard deviation in a 10L fermenter

10L罐發(fā)酵過(guò)程中VFA和NO2-的變化如圖4所示，對(duì)照組和添加組的NO2-濃度變化情況基本相同，分別在14h達(dá)到最高濃度52.5mmol/L和54.2mmol/L，并在18h分別降至最低值6.67mmol/L和7.43mmol/L，之后回升。這可能是由于菌體在發(fā)酵前期快速生長(zhǎng)（圖3），導(dǎo)致培養(yǎng)系統(tǒng)中的菌體處于缺氧狀態(tài)，地衣芽孢桿菌的硝酸鹽呼吸代謝啟動(dòng)，使NO2-濃度迅速提高，后隨著NO2-的進(jìn)一步代謝而快速降低。18h后，NO2-濃度變化出現(xiàn)顯著差異，18～34h，添加組的NO2-濃度是7.43～34.69mmol/L，顯著高于對(duì)照11.4%～154.9%。同時(shí)，22～34h，添加組的VFA是0.25～4.53g/L，低于對(duì)照10.3%～94.8%，說(shuō)明細(xì)胞通過(guò)硝酸鹽呼吸代謝消耗了NADH，減少了小分子揮發(fā)酸的生成[5]。18h后NO2-迅速積累，說(shuō)明谷氨酸起到了調(diào)控因子的作用，促進(jìn)了硝酸根的還原、增加了NADH的消耗，分流了細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生VFA所消耗的NADH，導(dǎo)致添加組的VFA的水平遠(yuǎn)低于對(duì)照組的水平[15]。

3 結(jié)論

在利用地衣芽胞桿菌發(fā)酵產(chǎn)桿菌肽的過(guò)程中，16～26h以3mg/（L·h）流加谷氨酸可以有效提高桿菌肽的產(chǎn)量，放罐效價(jià)達(dá)到1 020U/mL，且縮短了發(fā)酵周期約4h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，谷氨酸還促進(jìn)了硝酸還原酶的活性，提高細(xì)菌在缺氧條件下的生存能力。至于谷氨酸是如何提高硝酸還原酶的活性的，還有待進(jìn)一步研究。

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Effect of glutamate addition on bacitracin production byBacillus licheniformis

BAO Shuaishuai1,ZHANG Mo1,WANG Xinping1,CHEN Xiong1,CHEN Shouwen2,LI Junhui3,LI Dongsheng1,WANG Zhi1*
(1.College of Biotechnology,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China; 2.Lifecome Bioengineering Institute of Huazhong Agricultural University,Wuhan 430070,China; 3.Lifecome Biochemistry Co.,Ltd.,Pucheng 353400,China)

Effect of glutamate addition on bacteria metabolism and bacitracin synthesis during fermentation was studied.The bacitracin production increased 13.4%after adding 0.03 g/L glutamate acid into shaker flask during fermentation.The fermentation in 10 L bioreactor was conducted, 0.03 g/L glutamic acid was added into the bioreactor at the 16 h of fermentation,and the bacitracin titer reached the highest at the 36 h.During the 16-26 h of fermentation,glutamic acid was added at the rate of 3 mg/ml,the synthetic rate of bacitracin in 16-34 h was 34.0 U/(ml·h),increased 55.3% than the control group.Meanwhile,the increase rate of biomass was 20.2 μg/(ml·h),increased 17.4%than the control group,but the autolyzed time decreased 6 h.NO2-content was 11.4%to 154.9%higher than the control group from 18 h to 32 h.However,the volatile fatty acids content from 18 h to 32 h was 10.3%-94.8%lower than the control group from 22 h to 32 h.The results suggested that glutamic acid played an important role in regulating factors;it enhanced the NADH oxidation efficiency through NO2-synthesis,reduced the volatile fatty acids production,stimulated cell growth and favored bacitracin production in the end.

Bacillus licheniformis;bacitracin;glutamate acid;growth factor;synthesis precursor

TQ465

A

0254-5071（2014）03-0049-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.013

2014-01-21

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)綠康生物工程研究所科技攻關(guān)項(xiàng)目（2011090121）

鮑帥帥（1989-），男，碩士研究生，主要從事發(fā)酵工程的研究工作。

*通訊作者：王志（1971-），男，副教授，博士，主要從事代謝工程的研究工作。