程振玉，楊英杰*，劉治剛

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

超聲波輔助酶法提取北五味子多糖工藝研究

程振玉1，2，楊英杰1*，劉治剛1

（1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022；2.東北師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長春130024）

建立了超聲波輔助復(fù)合酶（纖維素酶/蛋白酶/果膠酶=1∶1∶1）提取北五味子多糖的方法。以多糖的提取率為研究指標(biāo)，通過設(shè)計正交試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，對超聲波輔助復(fù)合酶法提取北五味子多糖的工藝進行了優(yōu)化。確定最佳工藝條件為酶解溫度45℃，緩沖液pH 4.6，復(fù)合酶用量2%，酶解時間為2.0h，超聲波功率166W，萃取溫度56℃，萃取時間39 min。在此最佳條件下，北五味子多糖提取量達到105.36mg/g。超聲波輔助復(fù)合酶法應(yīng)用到多糖的提取領(lǐng)域，節(jié)省了時間，降低了溶劑消耗，且明顯提高了多糖的提取率，該法操作方便，簡單易行，為北五味子多糖工業(yè)化生產(chǎn)提取提供了理論依據(jù)。

北五味子；多糖；復(fù)合酶；超聲波；提取

北五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]為木蘭科多年生落葉藤本植物五味子的干燥成熟果實，是著名的滋補性中藥，被列為上品，最早記錄在《神農(nóng)本草經(jīng)》中，其應(yīng)用已經(jīng)有兩千多年的歷史[1-2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，北五味子主要活性成分多糖具有保肝、抗疲勞、抗氧化、抗腫瘤、免疫促進等重要作用[3-5]。因此，對五味子多糖的提取工藝進行系統(tǒng)考察，使多糖的提取率顯著提高，對擴大其應(yīng)用和工業(yè)化生產(chǎn)具有現(xiàn)實意義[6]。傳統(tǒng)方法中多糖的提取主要采用回流法[6-7]，該法耗費時間長，所需溫度高，能源耗費大，提取率低，且長時間的高溫極易導(dǎo)致多糖的降解，影響其藥理活性[8]。

近年來酶技術(shù)因其提取條件溫和，破壞細胞壁能力強，易水解植物中的膠質(zhì)、蛋白，能充分釋放細胞內(nèi)活性成分等特點已廣泛應(yīng)用于植物中有效成分的提取[9-11]，超聲波技術(shù)具有節(jié)省溶劑、提取時間短，操作簡單，提取效率高等特點亦成為現(xiàn)代天然藥物萃取的新方法[12-13]。因此本研究通過響應(yīng)面優(yōu)化試驗和正交試驗的設(shè)計，對復(fù)合酶-超聲波結(jié)合提取多糖的可行性及其工藝進行了研究，以期顯著提高北五味子多糖的提取率，使北五味子藥用資源得到充分的利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無水乙醇、石油醚、濃硫酸、鹽酸、苯酚、氫氧化鈉、檸檬酸均為分析純：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖：中國藥品生物制品鑒定所，批號100503-200702；木瓜蛋白酶（活力50 000U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；果膠酶（20 000U/g）、纖維素酶（活力15 000U/g）：上海藍季科技發(fā)展有限公司；五味子購買于吉林省通化市，產(chǎn)地為長白山地區(qū)，經(jīng)過吉林化工學(xué)院環(huán)境與生物工程學(xué)院隋新副教授鑒定為北五味子（Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.）的干燥果實。

1.2 儀器與設(shè)備

722可見分光光度計：上海欣茂儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SY-800超聲波清洗器：上海寧商超聲儀器有限公司；ZNCL-G智能恒溫磁力攪拌器：上海長城儀器科技有限公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：河南省鞏義市英峪儀器一廠；Allegra 64R（BACKMAN）離心機、RT-08多功能粉碎機：榮聰精密科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 藥材的預(yù)處理

取50℃干燥24h的北五味子，粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱取500.0g，置于索氏提取器中，加入一定量石油醚（60～90℃）脫脂，然后加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇回流除去色素、單糖、低聚糖和一些小分子物質(zhì)[7]。抽濾，除去濾液，得到預(yù)處理的北五味子。

1.3.2 酶法提取多糖工藝優(yōu)化正交試驗優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)已經(jīng)報道的酶法提取植物多糖的文獻[10，14]，選擇纖維素酶/蛋白酶/果膠酶=1∶1∶1作為復(fù)合酶。精確稱量預(yù)處理的五味子5.0g，加入一定量的復(fù)合酶，置于盛有100mL檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖溶液的圓底燒瓶中。調(diào)整緩沖液到一定pH值，將燒瓶置于智能恒溫磁力攪拌器中，在一定溫度條件下600r/min酶解一段時間。提取結(jié)束后，提取液離心，藥渣及燒瓶用少量蒸餾水洗滌后，繼續(xù)離心，合并2次所得上清液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮到原體積的1/5，加入無水乙醇至體積分?jǐn)?shù)達到80%。4℃靜置過夜，離心，收集沉淀，用無水乙醇洗滌3次，冷凍干燥得五味子粗多糖。在對單因素考察的基礎(chǔ)上，選用L9（34）正交試驗設(shè)計，以多糖提取量作為考察指標(biāo)，對酶解溫度，酶解時間，緩沖液pH和酶用量4個因素進行正交試驗，因素與水平見表1。

表1 酶解條件優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of the orthogonal test for hydrolysis condition optimization

1.3.3 超聲波輔助酶法提取多糖響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

根據(jù)正交試驗確定多糖的最優(yōu)提取條件，用復(fù)合酶提取多糖。酶法提取完成后，取出燒瓶，將其浸沒于盛有水的超聲波清洗器中輔助提取，以一定的功率在一定的溫度條件下萃取一段時間。萃取完成后，按照1.3.2項所述方法處理提取液，得北五味子粗多糖。根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗設(shè)計原理，在單因素的基礎(chǔ)上，選取對提取量影響比較大的3個因素（超聲功率、萃取溫度、萃取時間）進行優(yōu)化，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法，確定超聲波輔助酶法提取多糖的最佳工藝參數(shù)。試驗設(shè)計見表2。

表2 試驗因素水平編碼Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 多糖含量的測定

老人對呼倫說，我還以為這本書你用不著了。呼倫說那您也不能隨便往外借家里的東西??！老人說可是他參觀完你的書房以后硬要借走這本書……說他家里也有幾枚老古錢，想對著書看一下能不能挑出幾個值錢的。呼倫說您還帶別人參觀書房？老人撓撓頭皮說，不可以嗎？呼倫嘆一口氣，說，那這樣吧，明天您再幫我把書要回來……不是我想難為您，媽，如果是別的書也就罷了，可是我還得靠這本書寫我的稿子呢。老人想了想，說，可是我不知道他叫什么。

以多糖提取量作為研究指標(biāo)，用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)物，采用苯酚-硫酸法[15]，于恒溫25℃條件下在波長490nm處測吸光度值，以吸光度值A(chǔ)（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程y=0.0099x-0.017 9，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，在10～70μg/mL范圍內(nèi)葡萄糖含量與吸光度值呈良好的線性關(guān)系，可用于多糖含量的準(zhǔn)確分析。

2.2 酶法提取多糖工藝優(yōu)化的正交試驗結(jié)果分析

酶法提取多糖工藝優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析見表3，正交試驗結(jié)果方差分析見表4。

由表3可知，在復(fù)合酶提取多糖的工藝中，4個因素的影響順序依次為：緩沖液pH（B）>酶解時間（D）>酶解溫度（A）>酶用量（C），復(fù)合酶法提取北五味子多糖的最佳工藝條件組合是A1B3C3D2，即酶解溫度45℃，緩沖液pH值為4.6，復(fù)合酶用量為2%，酶解時間2.0h。在此最佳條件下進行驗證試驗，多糖提取量為85.16mg/g。

表3 酶解條件優(yōu)化正交試驗結(jié)果Table 3 Result of orthogonal test for hydrolysis condition optimization

表4 正交試驗結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal test for hydrolysis condition optimization

由表4可知，在影響復(fù)合酶提取多糖的因素中，緩沖溶液的pH影響極顯著，酶解時間有一定的影響，酶解溫度、酶用量幾乎沒有影響，與極差分析的結(jié)果吻合，驗證了極差分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 超聲波輔助酶法提取多糖響應(yīng)面結(jié)果分析

2.3.1 模型的建立及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗，試驗結(jié)果見表5，對其數(shù)據(jù)進行二次多項式逐步回歸擬合，回歸方程如下：

模型的可靠性可從方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察。由表6可知，該模型的F=28.75，P=0.000 1，證明該試驗所選用的二次多項模型極其顯著。在總的影響因素中，B、C、B2、C2項（P<0.05）對多糖的提取有極顯著的影響；而方程的交互項的P>0.05，表明其對五味子多糖的提取影響不顯著，各具體因子對響應(yīng)值的影響不是簡單的線性關(guān)系，各因子間的交互作用影響不顯著，可忽略。失擬項F=1.36，P> 0.05，說明無顯著性影響，數(shù)據(jù)中沒有異常點，模型適當(dāng)，不需要引入更高次數(shù)的項；回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=97.37%表明本試驗只有2.63%的數(shù)據(jù)不能用該模型來解釋，相關(guān)系數(shù)R2=97.37%與決定系數(shù)R2adj=93.98%相差不大，說明回歸方程擬合度高，該模型能很好地描述試驗結(jié)果，可以用來準(zhǔn)確分析和預(yù)測北五味子多糖的提取結(jié)果。

表5 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 5 Design and result of Box-Behnken

表6 回歸模型的方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

2.3.2 提取工藝的響應(yīng)曲面分析與優(yōu)化

為了更直觀地表現(xiàn)2個因素對多糖提取量的影響，可以把超聲功率、溫度、萃取時間3個因素中1個因素取零水平，另2個因素對多糖提取量的影響進行分析，圖2直觀地反映了因素間的交互作用對響應(yīng)值的影響。

圖2 各因素交互作用對影響多糖提取量的響應(yīng)面圖Fig.2 Response surfaces plot and contour plot of interaction among each two factors of temperature,time and power on polysaccharide extraction yield

由圖2可知，溫度和時間對多糖的提取量影響非常顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，響應(yīng)值變化較大；超聲功率對多糖的提取量影響較小，表現(xiàn)為曲線較為平緩，其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化都很小。

由Design-Expert軟件對試驗參數(shù)進一步優(yōu)化，可以得出最優(yōu)條件為超聲功率165.41W，萃取溫度55.96℃，萃取時間38.74min，在此條件下北五味子多糖的提取量可達到107.84mg/g。

2.4 最佳試驗條件的結(jié)果驗證

準(zhǔn)確稱取前處理北五味子5.0g，按照正交試驗所確定的最佳條件，首先用復(fù)合酶提取北五味子多糖，然后根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗所確定的最佳工藝，超聲波法輔助提取。根據(jù)實際操作的可行性，試驗將超聲波的工藝參數(shù)調(diào)整為超聲功率166W，提取溫度56℃，提取時間39min。在此工藝條件下，重復(fù)試驗3次，五味子多糖提取量為105.36mg/g，與響應(yīng)面預(yù)測值基本吻合，表明該方法能很好的提取北五味子多糖。

2.5 不同方法提取多糖的比較

根據(jù)本試驗所優(yōu)化的工藝條件，采用酶法和超聲波法分別直接提取北五味子多糖。酶法提取工藝為：稱取預(yù)處理的北五味子5.0g，加入2%的復(fù)合酶后，浸沒于100mL pH為4.6的檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖溶液，在45℃的恒溫智能恒溫磁力攪拌器中以600r/min的轉(zhuǎn)速攪拌2.0h，在此條件下，多糖的提取量為90.13mg/g；超聲波提取工藝為：稱取預(yù)處理的北五味子5.0g，加入100mL蒸餾水，以166W的功率在56℃提取39min，在此條件下，多糖的提取量為79.21mg/g；回流法根據(jù)文獻[16]報道的最佳提取條件，稱取預(yù)處理的北五味子5.0g，加入150mL蒸餾水，于90℃水浴中回流提取2h，提取3次，在此條件下，多糖提取量為84.79mg/g。本實驗所建立的超聲波輔助復(fù)合酶法，北五味子多糖的提取量最高，達到105.36mg/g。酶解破壞細胞壁能力強，超聲波輔助時間短，多糖提取量明顯提高，彌補了單一的酶法和超聲波分別提取活性成分的不足。與傳統(tǒng)回流法相比，時間更是顯著縮短，節(jié)約了資源，提高了效率。

3 結(jié)論

建立了超聲波輔助復(fù)合酶萃取北五味子多糖的方法。通過設(shè)計正交試驗和響應(yīng)面優(yōu)化試驗，確定了該法最優(yōu)工藝參數(shù)為酶解溫度45℃，緩沖液pH 4.6，復(fù)合酶用量2%，酶解時間為2.0h，超聲波功率166W，萃取溫度56℃，萃取時間39min。在此最佳條件下，北五味子多糖提取量達到105. 36mg/g。此法多糖提取量明顯高于回流法、酶法和超聲波法，原因可能是藥材經(jīng)過復(fù)合酶處理，細胞破壁能力增強，在后續(xù)的超聲波萃取過程中，溶劑分子對藥材基體的滲透和待提取成分的溶劑化被進一步加速，從而使活性成分的提取量得以顯著提高。超聲波輔助酶法萃取北五味子多糖所需時間短，能耗低且顯著提高了多糖的提取量，為工業(yè)化大量生產(chǎn)北五味子多糖提供了數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

[1]YANG F J,MA C H,YANG L,et al.Enrichment and purification of deoxyschizandrin and γ-schizandrin from the extract ofSchisandra chinensisfruit by macroporous resins[J].Molecules,2012,17(3):3510-3523.

[2]LIU Y,CHEN D F.Analysis ofSchisandra chinensisandSchisandra sphrnanthera[J].J Chromatogr A,2009,1216(11):1980-1990.

[3]CHEN Y,TANG J B,WANG X K,et al.An immunostimulatory polysaccharide(SCP-IIa)from the fruit ofSchisandra chinensis(Turcz.)Baill[J].Int J Biol Macromol,2012,50(3):844-848.

[4]ZHAO T,MAO G H,ZHANG M,et al.Anti-diabetic effects of polysaccharides from ethanol-insoluble residue ofSchisandra chinensis(Turcz) Baill on alloxan-induced diabetic mice[J].Chem Res Chinese U,2013, 29(1):9-l0.

[5]崔敬愛，陳曉平.五味子乙醇提取物抑菌活性研究[J].中國釀造，2013，32（9）：106-108.

[6]孟憲軍，李冬南，汪艷群，等.響應(yīng)曲面發(fā)優(yōu)化五味子多糖的提取工藝[J].食品科學(xué)，2010，31（4）：111-115.

[7]郭志欣，顧地周，宋宇輝，等.五味子藥渣中多糖提取工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：254-255．

[8]HROMáDKOV á Z,EBRINGEROV á A,VALACHOVIC P.Ultrasound-assisted extraction of water-soluble polysaccharides from the roots ofvalerian[J].Ultrason Sonochem,2002,9(1):37-44.

[9]ZHANG J,JIA S Y,LIU Y,et al.Optimization of enzyme-assisted extraction of theLycium barbarumpolysaccharides using response surface methodology[J].Carbohyd Polym,2011,86(2),1089-1092.

[10]YOU Q H，YIN X L，ZHAO Y P，et al.Enzyme assisted extraction of polysaccharides from the fruit ofCornus officinalis[J].Carbohyd Polym，2013，98（1）：607-610.

[11]董麗輝，范三輝，凌慶枝，等.酶法提取亮菌多糖的研究[J].中國釀造，2012，31（4）：51-54.

[12]刁小琴，關(guān)海寧.超聲輔助提取黑木耳多酚及其抑菌活性研究[J].食品工業(yè)，2013，34（3）：69-72.

[13]趙衛(wèi)星，姜紅波，溫普紅，等.正交超聲法提取五味子多糖研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2012，39（12）：2451-2453.

[14]YIN X L,YOU Q H,JIANG Z H,et al.Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides fromTricholoma matsutakeby response surface methodology[J].Carbohyd Polym,2011,86(3):1358-1364.

[15]DUBOIS M,GILLES K A,HAMILTON J K,et al.Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J].Anal Chem,1956, 28(3):350-356.

[16]許瑞波，嚴(yán)麗莉，章蕊.清北五味子多糖的提取及抗氧化活性分析[J].食品科學(xué)，2013，33（22）：85-89.

Technology of ultrasonic-assisted enzyme extraction of polysaccharide fromSchisandra chinensis

CHENG Zhenyu1,2,YANG Yingjie1*,LIU Zhigang1
(1.College of Chemical&Pharmaceutical Engineering,Jilin Institute of Chemical Technology,Jilin 132022,China; 2.School of Chemistry,Northeast Normal University,Changchun 130024,China)

The method of ultrasonic-assisted enzymatic extraction(cellulase:papain:pectinase was 1∶1∶1)of polysaccharide fromSchisandra chinensis was established.Orthogonal test and response surface methodology and was employed to optimize the technology conditions for extracting polysaccharide fromS.chinensis,taking polysaccharide extraction yield as evaluation index.The optimum extraction parameters of polysaccharides for ultrasonic-assisted enzyme were obtained as follows:hydrolysis temperature 45℃,buffer solution pH 4.6,compound enzyme 2%,hydrolysis time 2.0 h, ultrasonic power 166 W,extraction temperature 56℃,and extraction time 39 min.Under the optimal condition,the extraction yield of polysaccharides was 105.36 mg/g.The approach proposed in this study shortened extraction time,reduced solvent consumption,improved the extraction yield of polysaccharides.The method was easy and simple,providing theoretical basis for polysaccharide extraction fromS.chinensis.

Schisandra chinensis;polysaccharide;compound enzyme;ultrasonic;extraction

R284.2

A

0254-5071（2014）03-0104-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.03.025

2014-01-16

程振玉（1986-），男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué)。

*通訊作者：楊英杰（1955-），男，教授，本科，研究方向為天然藥物化學(xué)。