楊尚東 趙久成 郭伊娟 吳 俊 龍明華

（1 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院園藝系，廣西南寧 530004；2 廣西作物遺傳改良生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院，廣西南寧 530007）

番茄青枯病是一種典型的土傳病害，是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的細(xì)菌性維管束病害。國內(nèi)外針對(duì)該病害的防治方法開展了大量的研究（Minuto et al.，2006；譚兆贊 等，2009），但至今仍未找到理想的防治措施。

生物防治是一項(xiàng)有望于預(yù)防和解決包括青枯病等土傳病害的技術(shù)，但傳統(tǒng)的生物防治技術(shù)將拮抗菌導(dǎo)入土壤后成功的例子很少。究其原因，就是因?yàn)榻臃N的拮抗菌與土著微生物之間存在著激烈的競爭關(guān)系，拮抗菌進(jìn)入土壤后，其生存競爭能力往往低于土著微生物而難以大量繁殖，從而難以發(fā)揮出應(yīng)有的拮抗能力（郭堅(jiān)華 等，1997）。已有的研究表明：當(dāng)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富，物種越均勻，多樣性越高時(shí)，對(duì)抗病原菌的綜合能力越強(qiáng)（Nishiyama et al.，1999；陸合和張碧波，2009）。但番茄植株罹患青枯病是否與根際土壤微生物多樣性下降有關(guān)還鮮見報(bào)道。

本試驗(yàn)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）技術(shù)，在比較分析番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤理化性狀、生物學(xué)特征的基礎(chǔ)上（楊尚東 等，2013），進(jìn)一步分析番茄青枯病罹病植株和健康植株根際微生物群落結(jié)構(gòu)之間的差異，擬為預(yù)防和提高番茄青枯病生物防治技術(shù)的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試番茄（Solanum lycopersicumL.）品種為中果型番茄品種0626。

2012年3月下旬在廣西武鳴縣太平鎮(zhèn)文溪村番茄基地隨機(jī)選取番茄健康植株和青枯病罹病植株各15株。青枯病病原菌及病株的鑒定與診斷由武鳴縣植保站技術(shù)服務(wù)部完成。其中，罹病植株分別選取重度萎蔫（4片葉以上至全株枯萎）和輕度萎蔫（1～2片葉萎蔫）的病株。挖出整個(gè)根系，采用抖根分離法（云鵬 等，2010）取根系所粘土壤，即為根際土壤。

1.2 儀器設(shè)備

變性梯度凝膠電泳（DGGE）所用儀器為DCodeTM突變檢測儀（Univertion Mutantion Detection System，Bio-Rad Pacific limited，USA）。凝膠成像儀和梯度PCR 儀均為美國Bio-Rad 生產(chǎn)。

1.3 測定項(xiàng)目

1.3.1 土壤基因組總DNA 的提取 參照Krsek 和Welingto（1999）的方法進(jìn)行。

1.3.2 基因組總DNA 的純化 采用生工生物工程（上海）股份有限公司的DNA 膠回收試劑盒 （Biospin gel extraction kit，Bioflux，產(chǎn) 品號(hào)：bsc02m1）對(duì)DNA 粗提取液進(jìn)行純化；并采用核酸蛋白測定儀（Eppendorf AG，德國）進(jìn)行檢測。純化后樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 土壤細(xì)菌16S rDNA基因V3可變區(qū)的擴(kuò)增

16S rDNA基因V3可變區(qū)的擴(kuò)增以及PCR 反應(yīng)分別參照Li 等（2008）和劉瑋等（2010）的方法進(jìn)行。其中，特異性引物對(duì)F338GC 和R518 的序列分別為5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGG CGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGC AG-3′和5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約230 bp；50 μL PCR 反應(yīng)體系：10×PCR buffer（加 MgCl2）5.0 μL，dNTPs（10 mmol·L-1）1.0 μL，上游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，下游引物（10 μmol·L-1）1.0 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.5 μL，模 板DNA（50 ng·μL-1）1.0 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)齊50 μL。PCR 反應(yīng)按照van Hannen 等（1999）的方法進(jìn)行，PCR 產(chǎn)物用1.5%（m/V）瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物的變性梯度 凝膠電泳分析采用DCodeTM基因突變檢測系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳分析。其中，變性膠的制備參照Sambrook 等（2002）的方法進(jìn)行；待膠完全凝固后，將膠板放入裝有1×TAE 電泳緩沖液的裝置中，在每個(gè)加樣孔中加入含有3∶1 的6×溴酚藍(lán)二甲苯氰溶液的PCR 樣品20～30 μL。電泳及染色參照Yu 和Morrison（2004）的方法進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐富度（Richness，S）測定采用數(shù)條帶的方法，多樣性指數(shù)（Shannon-Wiener index，H）和均勻度（Evenness，EH）的計(jì)算方法采用羅海峰等（2004）的方法。聚類分析和相似性系數(shù)分析采用Quantity one 軟件。

式中，Ni表示某一泳道中某一條帶的OD值，N是某一泳道中所有條帶OD值的總和，pi是某個(gè)土壤樣品中單一條帶的強(qiáng)度在該樣品所有條帶總強(qiáng)度中所占的比率；S是某個(gè)土壤樣品中所有條帶數(shù)目的總和。

2 結(jié)果與分析

2.1 根際土壤細(xì)菌總DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增

分別從番茄健康植株和青枯病罹病植株根際土壤中提取總DNA，取4 μL DNA 樣品，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖1可以看出，提取的總DNA亮度較好，而且無明顯拖帶現(xiàn)象，大小均為2 310 bp 左右。另外，在核酸蛋白測定儀上測定OD260和OD280的值，OD260/OD280值介于1.8～2.0 之間，說明所得到的總DNA 質(zhì)量符合試驗(yàn)要求（徐曉宇 等，2005）。

圖1 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤總DNA電泳圖譜

如圖2所示，番茄健康植株和青枯病罹病植株根際土壤細(xì)菌16S rDNA 經(jīng)PCR 擴(kuò)增后的DNA片段長度為250 bp 左右，特異性好、無雜帶，與理論值（230 bp）相符。說明該P(yáng)CR 程序適用于16S rDNA 的擴(kuò)增，并且能夠得到較好的產(chǎn)物。

圖2 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌16S rDNA基因V3可變區(qū)PCR 擴(kuò)增圖譜

2.2 根際土壤細(xì)菌DNA 的PCR-DGGE 分析

應(yīng)用DGGE 技術(shù)分離16S rDNA基因V3片段PCR 產(chǎn)物，可分離到數(shù)目不等、位置各異的電泳條帶（圖3）。根據(jù)DGGE 能分離長度相同而序列不同DNA 的原理，每一個(gè)條帶大致與群落中的一個(gè)優(yōu)勢菌群或操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）相對(duì)應(yīng)，條帶數(shù)越多，說明生物多樣性越豐富；條帶染色后的熒光強(qiáng)度越亮，表示該種屬的數(shù)目越多。從而反映土壤中的微生物種類和數(shù)量（Krsek & Welington，1999）。

采用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)DGGE 圖譜進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖3）：與番茄健康植株相比，青枯病罹病植株根際土壤DGGE 圖譜中條帶的位置和數(shù)目均存在較大的差異；同時(shí)，輕度萎蔫和重度萎蔫的番茄青枯病罹病植株根際土壤的DGGE 條帶數(shù)目和位置亦存在較大差異。

從圖3還可以看出，番茄青枯病罹病植株與健康植株根際土壤細(xì)菌DGGE 圖譜的條帶數(shù)量大小順序?yàn)椋航】抵仓辏⊿為14）＞青枯病罹病植株（輕度萎蔫）（S為10）＞青枯病罹病植株（重度萎蔫）（S為7），表明番茄植株根際土壤細(xì)菌豐度以健康植株為最大，并隨著青枯病罹患程度的加重而降低，這可能與番茄植株罹患青枯病后根際土壤的理化性狀及生物學(xué)特性均隨著感病程度的加劇而下降有關(guān)。另一方面，DGGE 圖譜中各泳道的條帶粗細(xì)不一，對(duì)應(yīng)其在DGGE 膠上的密度大小不同，密度大，則條帶比較粗黑；密度小，則條帶比較細(xì)。其中1、2、4、6、7、8、9、12、13、14、15號(hào)條帶是健康植株和罹病植株根際土壤共有的條帶，而5、10、11號(hào)條帶是健康植株根際土壤的特有條帶（圖3）。

圖3 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌的DGGE 圖譜和DGGE 條帶強(qiáng)度示意圖

根據(jù)細(xì)菌16S rDNA 的PCR-DGGE 圖譜中條帶的位置和亮度的數(shù)值化結(jié)果計(jì)算細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)指標(biāo)Shannon-Wiener 指數(shù)。薛冬等（2007）的研究表明：Shannon-Wiener 指數(shù)越大，表明細(xì)菌群落多樣性越高。分析番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌的多樣性指數(shù)，結(jié)果表明（表1）：番茄根際土壤細(xì)菌豐度及多樣性指數(shù)的大小順序?yàn)椋航】抵仓辏厩嗫莶☆静≈仓辏ㄝp度萎蔫）＞青枯病罹病植株（重度萎蔫）。表明番茄植株罹患青枯病并出現(xiàn)萎蔫癥狀后，根際土壤細(xì)菌豐度和多樣性指數(shù)下降，并隨著萎蔫程度的加劇豐度和多樣性指數(shù)下降更為明顯。

均勻度是表示物種在環(huán)境中的分布狀況，各物種數(shù)目越接近，均勻度數(shù)值越高（吳展才 等，2005）。從表1可以看出，番茄植株罹患青枯病后亦導(dǎo)致了根際土壤細(xì)菌均勻度的降低，但隨著萎蔫程度的加劇均勻度呈現(xiàn)回升的趨勢。表明番茄植株罹患青枯病后，導(dǎo)致部分種屬細(xì)菌數(shù)量變多，部分種屬細(xì)菌數(shù)量變少。

表1 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌種群多樣性指數(shù)、豐度和均勻度

對(duì)所得DGGE 圖像采用非加權(quán)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明（圖4）：番茄根際土壤細(xì)菌基本上分為兩大簇群，其中青枯病罹病植株分為一大簇群，健康植株分為另一大簇群。表明番茄植株罹患青枯病后明顯改變了根際土壤細(xì)菌的群落多樣性。

圖4 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌16S rDNA 的聚類分析結(jié)果

對(duì)番茄青枯病罹病植株與健康植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行相似性分析。結(jié)果顯示（表2），番茄青枯病罹病植株中輕度萎蔫植株、重度萎蔫植株與健康植株之間根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性系數(shù)分別為55.5%和65.5%，而輕度萎蔫植株與重度萎蔫植株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似性系數(shù)為69.1%。表明番茄植株罹患青枯病后導(dǎo)致根際土壤細(xì)菌群落發(fā)生顯著變化。

表2 番茄青枯病罹病植株和健康植株根際土壤細(xì)菌群落的相似性系數(shù)

3 結(jié)論與討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)變化的敏感指標(biāo)之一，其活性和群落結(jié)構(gòu)變化能反映出土壤生態(tài)系統(tǒng)的質(zhì)量和健康狀況（鐘文輝和蔡祖聰，2004）。傳統(tǒng)研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化的方法多采用培養(yǎng)法，但由于土壤中只有極小部分微生物是可培養(yǎng)的（Amann et al.，1995），因此采用傳統(tǒng)方法所獲得的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)信息是極其有限的。自從Muyzer 等（1993）首次將PCR-DGGE 技術(shù)應(yīng)用于微生物生態(tài)學(xué)研究以來，近年來已有很多學(xué)者將其作為研究微生物群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)變化的分子工具之一（Girvan et al.，2004；秦華 等，2010；顧美英 等，2012）。例如：張鵬等（2013）采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR、PCR-DGGE 技術(shù)研究生物有機(jī)肥對(duì)連作番茄根際土壤微生物區(qū)系及茄科雷爾氏菌的影響，結(jié)果表明施用生物有機(jī)肥提高了番茄和辣椒根際土壤微生物的多樣性指數(shù)、豐度和均勻度，其減輕青枯病為害的原因與調(diào)控根際土壤微生物的組成有關(guān)。此外，朱紅惠等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，青枯病抗性不同的番茄品種根際拮抗菌存在差異，從抗病品種根際土壤中獲得的拮抗菌較多。張海利等 （2008）的研究亦指出，番茄青枯病發(fā)病嚴(yán)重的品種，其植株根際的拮抗菌群落多樣性低且拮抗能力較弱，輕微發(fā)病品種和未發(fā)病品種植株根際中篩選到的拮抗菌株數(shù)較多且拮抗能力較強(qiáng)。

本試驗(yàn)采用PCR-DGGE 技術(shù)比較分析了番茄青枯病罹病植株和健康植株根際細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化，同樣發(fā)現(xiàn)健康植株根際土壤細(xì)菌DGGE 圖譜的條帶數(shù)量（豐度）不僅明顯高于青枯病罹病植株，而且條帶獨(dú)立且亮度高于后者。這一結(jié)果與朱紅惠等（2003）和張海利等（2008）的研究結(jié)果相似，說明番茄罹病植株根際土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)、豐度和均勻度下降或許就是導(dǎo)致植株出現(xiàn)青枯病為害癥狀的重要原因，而具有較高多樣性指數(shù)、豐度和均勻度的根際土壤可能也是健康植株尚未出現(xiàn)青枯病為害癥狀的重要原因之一。

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