謝小平 劉長遠(yuǎn) 趙奎華 王 輝 關(guān)天舒 梁春浩 賈 姝 張 里

（1 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，遼寧沈陽110866；2 遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，遼寧沈陽110161）

辣椒疫?。≒hytophthora capsiciLeonian）是北方設(shè)施辣椒生產(chǎn)上的重要土傳病害，在防治上主要以化學(xué)防治為主，因化學(xué)防治存在農(nóng)藥殘留問題，因此，生物菌劑研究已逐漸成為防治辣椒疫病的熱點(diǎn)。黃柄曲霉（Aspergillus flavipes）屬于曲霉屬，研究發(fā)現(xiàn)黃柄曲霉對(duì)植物病害真菌有較好的抑制作用。李淑彬等（2001）從大亞灣海底沉積物中分離出1株具有廣譜抗真菌作用的黃柄曲霉，對(duì)辣椒疫病菌（Phytophthora capsici）、新月彎孢霉（Curvularia lunata）、棉炭疽菌（Colletotrichum gossypii）等多種植物病原真菌有強(qiáng)烈抑制作用。王輝等（2012）研究表明黃柄曲霉ASD菌株對(duì)辣椒疫病有較好的防治效果，其防效優(yōu)于化學(xué)藥劑代森錳鋅和烯酰嗎啉，但對(duì)抑菌物質(zhì)種類和結(jié)構(gòu)未作深入研究。本試驗(yàn)以黃柄曲霉ASD菌株為研究對(duì)象，主要開展了抑菌譜測定和抑菌物質(zhì)的提取，以期為該菌株生防菌劑研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 黃柄曲霉ASD菌株，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所園藝作物病害研究室提供。

1.1.2 供試病原菌 辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌（Phytophthora infestans）、黃瓜蔓枯病菌（Mycosphaerella melonis）、甜瓜蔓枯病菌（Didymella bryoniae）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、葡萄炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinereaPers.）、梨輪紋病菌（Physalospora piricolaNose）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、茄子根腐病菌（Fusarium solani），均由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所園藝作物病害研究室提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉12 g，蒸餾水1 000 mL。

PD 培養(yǎng)液：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 ASD菌株抑菌譜的測定 采用對(duì)峙培養(yǎng)法（Getha & Vikineswary，2002），在直徑為9 cm 的PDA 平板上相距2.5 cm 的位置放置直徑為0.6 cm的ASD菌餅及供試病原菌菌餅，于25℃培養(yǎng)4 d，測量抑菌帶寬度。

1.2.2 ASD菌株的發(fā)酵培養(yǎng) ASD菌株在PDA 平板上27℃培養(yǎng)5 d后，取菌體接種于裝有100 mL PD 培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，27℃、150 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)5d（王輝，2012）。

1.2.3 ASD菌株發(fā)酵液的制備 發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵原液，12 000 r·min-1離心30 min，取上清液用微孔濾膜去除菌體，即為ASD菌株的發(fā)酵液（Ji et al.，2007），采用牛津杯法檢測其抑菌活性。

1.2.4 硫酸銨分段鹽析條件確定 取發(fā)酵液用不同飽和度的硫酸銨（10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%）分級(jí)沉淀，4℃靜止過夜后，12 000 r·min-1離心30 min 棄上清液，分別收集每一個(gè)飽和度的沉淀物（陳雪麗 等，2006）。沉淀物用少量體積的0.01 mol·L-1磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.2）溶解，裝入透析袋中，用雙蒸水透析去鹽并用聚乙二醇6000 包埋濃縮后即得到抑菌物質(zhì)粗提物。

1.2.5 抑菌活性的測定 采用含毒介質(zhì)法（全鑫 等，2010；唐琳和趙輝，2011）檢測抑菌物質(zhì)粗提物的抑菌活性。將抑菌物質(zhì)粗提物與PDA 培養(yǎng)基按照1∶10的比例混合倒平板，以PDA 培養(yǎng)基作為對(duì)照，在平板的中心放置1個(gè)辣椒疫病菌菌餅，3次重復(fù)，置于27℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，觀察辣椒疫病菌的生長情況。

1.2.6 蛋白酶對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響 取50%硫酸銨飽和度提取的抑菌物質(zhì)粗提物與按1∶1∶1的比例混合的胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶E 發(fā)生反應(yīng)，蛋白酶濃度為1 mg·mL-1，在恒溫 37℃下反應(yīng) 1 h（高小寧，2012）。采用含毒介質(zhì)法檢測經(jīng)酶解后抑菌物質(zhì)粗提物的抑菌活性，以辣椒疫病菌為指示菌，每處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃柄曲霉ASD菌株抑菌譜測定

由表1可知，黃柄曲霉ASD菌株對(duì)辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌、甜瓜蔓枯病菌、黃瓜蔓枯病菌、黃瓜炭疽病菌、葡萄炭疽病菌、葡萄灰霉病菌、梨輪紋病菌、小麥赤霉病菌、茄子根腐病菌均有抑制作用，抑菌譜較廣，其抑菌帶的寬度為2.9～11.8 mm，其中對(duì)辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有較強(qiáng)的抑制作用（圖1）。

表1 黃柄曲霉ASD菌株的抑菌譜及抑菌帶寬度

圖1 黃柄曲霉ASD菌株對(duì)辣椒疫病菌和番茄晚疫病菌的抑制效果

2.2 黃柄曲霉ASD菌株發(fā)酵液的抑菌活性檢測

從平板抑菌活性試驗(yàn)可以看出，黃柄曲霉ASD菌株的發(fā)酵液對(duì)辣椒疫病菌有很強(qiáng)的抑菌活性，ASD菌株200 μL 發(fā)酵液對(duì)辣椒疫病菌的抑菌帶寬度為7.4 mm（圖2）。

圖2 黃柄曲霉ASD菌株發(fā)酵液對(duì)辣椒疫病菌的抑菌活性

2.3 黃柄曲霉ASD菌株抑菌物質(zhì)粗提物對(duì)辣椒疫病菌的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果顯示（表2），經(jīng)10%～90%飽和硫酸銨沉淀后的抑菌物質(zhì)粗提物對(duì)辣椒疫病菌均有抑制活性，其中經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀后的抑菌物質(zhì)對(duì)辣椒疫病菌的抑制活性最強(qiáng)（圖3），抑制效果達(dá)到80.78%。由此說明，經(jīng)50%飽和硫酸銨沉淀的物質(zhì)是具有抑菌效果的抑菌物質(zhì)。

表2 經(jīng)不同飽和度硫酸銨沉淀后的ASD菌株抑菌物質(zhì)粗提物對(duì)辣椒疫病菌的抑制作用

圖3 經(jīng)50%硫酸銨飽和度沉淀的抑菌物質(zhì)對(duì)辣椒疫病菌的抑菌效果

2.4 黃柄曲霉ASD菌株抑菌物質(zhì)粗提物經(jīng)酶解后對(duì)辣椒疫病的抑制作用

抑菌活性檢測結(jié)果表明，50%硫酸銨飽和度沉淀的抑菌物質(zhì)粗提物經(jīng)胰蛋白酶、蛋白酶 K 和蛋白酶 E處理后，對(duì)辣椒疫病菌幾乎無抑制作用，由此說明，經(jīng)50%硫酸銨飽和度沉淀提取的抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

黃柄曲霉ASD菌株是從土壤中分離得到的，該菌對(duì)辣椒疫病具有較好的防治效果。本試驗(yàn)結(jié)果表明黃柄曲霉ASD菌株對(duì)多種植物病原真菌有不同程度的抑制作用，特別對(duì)辣椒疫病菌、番茄晚疫病菌有較強(qiáng)的抑制作用，采用硫酸銨分級(jí)沉淀的方法可得到黃柄曲霉ASD菌株的抑菌物質(zhì)粗提物，50%硫酸銨飽和度沉淀出的抑菌物質(zhì)粗提物對(duì)辣椒疫病菌的抑制活性最強(qiáng)，抑菌效果達(dá)到80.78%，并確定其為蛋白類物質(zhì)。

黃柄曲霉是一種分布廣泛的土壤真菌，在防治植物病害方面報(bào)道較少。該菌在代謝過程中能夠產(chǎn)生細(xì)胞壁水解酶，抑制一些病原真菌生長（郭雷 等，2013）。蔣亭等（2002）從黃柄曲霉中分離得到7種化合物，大部分有抑菌活性；李淑彬等（2001）從海底沉積物中分離得到的黃柄曲霉可產(chǎn)生一種廣譜抗真菌抗生素179M。本試驗(yàn)通過對(duì)ASD菌株抑菌物質(zhì)的初步研究，明確了其具有潛在的植物病害生物防治價(jià)值。

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郭雷，朱文成，劉瑋煒，丁國偉，張?jiān)角?，張守祿，邱月，謝宇.2013.抗菌活性海洋真菌HN4-13 的鑒定及其發(fā)酵優(yōu)化.微生物學(xué)通報(bào)，（6）：38-45.

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