劉 晶 王美艷 范世華

(東北大學(xué) 理學(xué)院 分析科學(xué)研究中心，沈陽(yáng) 110004)

0 前言

亞硫酸鹽通常指二氧化硫及能夠產(chǎn)生二氧化硫的無(wú)機(jī)性亞硫酸鹽，在食品加工中廣泛用作漂白劑、防腐劑和抗氧化劑；二氧化硫是葡萄酒釀造過(guò)程中不可缺少的添加劑，其主要功能是防腐殺菌、澄清、抗氧化和增酸、增色、改善果酒風(fēng)味等[1]，但過(guò)量使用亞硫酸鹽類(lèi)食品添加劑會(huì)破壞食品的營(yíng)養(yǎng)素。人類(lèi)若食用過(guò)量的亞硫酸鹽會(huì)產(chǎn)生頭痛、惡心、暈眩、氣喘、蕁麻疹等過(guò)敏反應(yīng)[2]。目前亞硫酸鹽的安全性問(wèn)題已引起越來(lái)越多的關(guān)注。

SO32-定量測(cè)定方法有高效液相色譜法[3]、氣相色譜法[4]、離子色譜法[5]、熒光光譜分析法[6]、化學(xué)發(fā)光法[7]、分光光度分析法[8]等。在我國(guó)測(cè)定二氧化硫常用的方法是鹽酸副玫瑰苯胺-甲醛比色法。但鹽酸副玫瑰苯胺-甲醛比色法手工操作繁瑣、空白背景大、重現(xiàn)性差，所使用的試劑四氯汞鉀和甲醛等毒性較強(qiáng)，易對(duì)環(huán)境造成新的污染；同時(shí)該方法對(duì)鹽酸的加入量要求十分苛刻，因此在應(yīng)用上受到一定限制。而順序注射法與分光光度分析法聯(lián)用技術(shù)在無(wú)機(jī)離子及有機(jī)物測(cè)定方面得到了很好的應(yīng)用[9-10]。本文基于孔雀綠與二氧化硫的褪色反應(yīng)，將順序注射進(jìn)樣氣體擴(kuò)散分離與光度分析法聯(lián)用，快速、準(zhǔn)確地測(cè)定了葡萄酒中SO2的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

SIS-4100四道順序注射系統(tǒng)(北京吉天儀器公司)：由注射泵、8位選擇閥和5 mL針筒組成，注射器和多位閥的操作由計(jì)算機(jī)控制；722光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；氣體擴(kuò)散膜(自行加工)；PCL-711B數(shù)據(jù)采集卡(Advantech CO.，臺(tái)灣)。

無(wú)水亞硫酸鈉(CP)、乙二胺四乙酸二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、鹽酸(36%～38%)，購(gòu)自沈陽(yáng)市試劑廠；孔雀石綠(BS)購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水碳酸鈉和碳酸氫鈉購(gòu)自上海虹光化工廠。上述試劑除另有說(shuō)明，皆為分析純，水為二次去離子水。

EDTA鈉鹽溶液(0.001 mol/L)、磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(0.025 mol/L)、孔雀綠儲(chǔ)備溶液(4×10-3mol/L)、二氧化硫標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 000 mg/L)。

孔雀綠工作溶液：準(zhǔn)確移取10 mL磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液(0.125 mol/L)于50 mL容量瓶中，加入適量水稀釋后，再加入一定體積的孔雀綠標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，稀釋后定容至刻度，搖勻，配制成適當(dāng)濃度的孔雀綠工作溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

按照?qǐng)D1所示的實(shí)驗(yàn)流路，SI系統(tǒng)通過(guò)八位選擇閥的一個(gè)閥位通道對(duì)整個(gè)流路用水進(jìn)行沖洗后，將含有孔雀綠指示劑的溶液吸入儲(chǔ)存管并反向推至氣體擴(kuò)散膜的接收液流通道；然后沖洗儲(chǔ)存管路后再依次將試樣、試劑順序地吸入儲(chǔ)存管，并反向?qū)⑵渫迫虢o予液流通道進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生的氣態(tài)二氧化硫經(jīng)PTFE膜擴(kuò)散進(jìn)入給予液流通道，最后將給予液流中的指示劑溶液推入流通池，在波長(zhǎng)615 nm處實(shí)時(shí)記錄吸光度信號(hào)。測(cè)定試劑空白的吸光度A0和顯色反應(yīng)后溶液的吸光度A，并計(jì)算吸光度差值A(chǔ)0-A。全部操作過(guò)程在計(jì)算機(jī)控制下按一定程序完成。

圖1 氣體擴(kuò)散-順序注射分光光度法測(cè)定流路圖Figure 1 Schematic diagram of SIA system with gas diffusion for spectrophotometric determination.C—載流；VSP—兩位閥；SP—注射泵；MPV—八位選擇閥；D—檢測(cè)器；W—廢液；HC—儲(chǔ)存管(i.d. 0.8 mm，管長(zhǎng)200 cm)；RC—反應(yīng)管(i.d. 0.8 mm，管長(zhǎng)30 cm)；R1—HCl溶液；R2—孔雀綠溶液；S—試樣溶液

2 結(jié)果與討論

2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜見(jiàn)圖2。在350～750 nm的范圍內(nèi)，顯色產(chǎn)物在615 nm處的吸光度最大，實(shí)驗(yàn)選定615 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖2 吸收光譜曲線Figure 2 Absorption spectra.

2.2 檢測(cè)流速的選擇

實(shí)驗(yàn)采用氣體擴(kuò)散分離裝置在順序注射進(jìn)樣條件下將待測(cè)組分與基體分離，因此需要優(yōu)化試樣與鹽酸混合反應(yīng)后流經(jīng)給予液流通道的速度即給予液流速V1和吸收了擴(kuò)散SO2的孔雀綠指示劑溶液進(jìn)入檢測(cè)器的速度即接收液流速V2。

給予液流速V1對(duì)吸光度差值的影響如圖3。給予液流通道是試樣與試劑反應(yīng)生成SO2的通道，流速V1越小，試劑與試樣在管路中的留存時(shí)間及反應(yīng)時(shí)間就越長(zhǎng)，所生成的SO2越多，通過(guò)氣體擴(kuò)散分離器后轉(zhuǎn)化為SO32-的量越大，與指示劑進(jìn)行加成反應(yīng)的程度也就越大，指示劑褪色也就越明顯。在實(shí)驗(yàn)中兼顧靈敏度及取樣頻率，選擇其流速V1為1.2 mL/min。

圖3 給予液流速V1對(duì)吸光度差值的影響 Figure 3 Effect of V1 flow rate on relative absorbance.

接收液流速V2對(duì)吸光度差值的影響如圖4。由圖可知，吸光度差值隨系統(tǒng)流速V2的增加而明顯降低。這是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中，接收液流通道中的孔雀綠指示劑在弱堿性條件下，與經(jīng)擴(kuò)散進(jìn)入通道的SO2轉(zhuǎn)化為SO32-后發(fā)生加成反應(yīng)，使孔雀綠結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而導(dǎo)致其褪色。由于加成反應(yīng)的反應(yīng)速率較為緩慢，若流速V2過(guò)快，減少了反應(yīng)時(shí)間，會(huì)使SO32-無(wú)法充分與指示劑發(fā)生加成反應(yīng)，降低反應(yīng)進(jìn)行的程度，進(jìn)而導(dǎo)致吸光度差值較小。流速V2為1.2 mL/min時(shí)，可以獲得相對(duì)高的靈敏度和較大的取樣頻率，因此實(shí)驗(yàn)中選擇1.2 mL/min作為最佳的系統(tǒng)流速V2值。

圖4 給予液流速V2對(duì)吸光度差值的影響 Figure 4 Effect of V2 flow rate on relative absorbance.

2.3 試樣體積的選擇

實(shí)驗(yàn)觀察到，隨著試樣體積的增加，吸光度總值增加。這是因?yàn)殡S著與鹽酸發(fā)生反應(yīng)的試樣增多，產(chǎn)生的SO2也增多，因此吸光度差值迅速增大；試樣體積增大到200 μL以后趨于平緩，這是由于在管路中進(jìn)行的化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在試樣與試劑相互滲透的界面上，當(dāng)樣品體積增大到200 μL時(shí)，過(guò)多的試樣溶液在管路中無(wú)法與鹽酸進(jìn)一步接觸滲透，所以產(chǎn)生的SO2量沒(méi)有明顯增多，因此吸光度差值增加較緩慢。兼顧靈敏度和分析速度，實(shí)驗(yàn)選擇200 μL作為試樣的最佳進(jìn)樣體積。

圖5 試樣體積對(duì)吸光度差值的影響Figure 5 Effect of sample volume on relative absorbance.

2.4 鹽酸溶液和孔雀綠溶液體積的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吸光度差值隨鹽酸體積的增加而逐漸增加，但增加幅度不是很明顯。實(shí)驗(yàn)確定選擇100 μL作為鹽酸的最佳體積，孔雀綠溶液的體積對(duì)吸光度差值的影響如圖6所示。孔雀綠溶液為本實(shí)驗(yàn)的指示劑，其體積的增加，可以減少兩端載流對(duì)擴(kuò)散膜處的指示劑區(qū)帶的稀釋?zhuān)瑥亩ＷC給予液流區(qū)帶中央部位(與位于擴(kuò)散單元中給予液流相對(duì)應(yīng)部位)能有較高濃度的孔雀綠與擴(kuò)散過(guò)來(lái)的SO2發(fā)生反應(yīng)，以增加靈敏度并獲得較好的重現(xiàn)性。當(dāng)孔雀綠體積在100～200 μL范圍內(nèi)變化時(shí)，吸光度差值隨孔雀綠體積的增加而逐漸增大；當(dāng)體積達(dá)到200 μL并繼續(xù)增大時(shí)，吸光度差值基本不再變化，因此選擇200 μL作為孔雀綠溶液的最佳體積。

圖6 孔雀綠體積對(duì)吸光度差值的影響 Figure 6 Effect of MG volume on relative absorbance.

2.5 鹽酸濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，系統(tǒng)中所使用的鹽酸濃度不同會(huì)直接影響吸光度差值的大小。隨著鹽酸濃度的增加，吸光度差值也隨之增加；當(dāng)濃度達(dá)到0.5 mol/L時(shí)吸光度差值達(dá)到最大；繼續(xù)增加鹽酸濃度，吸光度差值則緩慢降低，如圖7所示。實(shí)驗(yàn)選擇0.5 mol/L作為HCl的最佳工作濃度。

圖7 HCl濃度對(duì)吸光度差值的影響 Figure 7 Effect of HCl concentration on relative absorbance.

2.6 孔雀綠溶液濃度的選擇

試樣中產(chǎn)生的SO2透過(guò)氣體擴(kuò)散膜進(jìn)入到孔雀綠溶液中，在堿性條件下SO2轉(zhuǎn)化為SO32-后，與孔雀綠發(fā)生加成反應(yīng)使其褪色，因此孔雀綠溶液的濃度直接影響空白溶液的吸光度值及加成反應(yīng)的褪色程度。如圖8所示，吸光度差值隨孔雀綠濃度的增大而顯著增大，但濃度太高會(huì)導(dǎo)致吸光度超過(guò)儀器的線性響應(yīng)范圍。為保證其空白吸光度控制在光度計(jì)的線性響應(yīng)范圍內(nèi)并獲得較高的靈敏度，選擇2.0×10-4mol/L作為孔雀綠的最佳濃度，此時(shí)空白信號(hào)的吸光度約為1.40。

圖8 孔雀綠濃度對(duì)吸光度差值的影響 Figure 8 Effect of MG concentration on relative absorbance.

2.7 共存組分的干擾

在氣體擴(kuò)散分離過(guò)程中，氣體擴(kuò)散膜將大部分的非揮發(fā)性基體組分隔離在給予液流通道的一側(cè)，消除了其對(duì)指示劑褪色反應(yīng)的干擾，然而在基體組分中仍可能存在酸性條件下轉(zhuǎn)化為氣態(tài)的氣體組分(如二氧化碳等)，同樣也可以透過(guò)擴(kuò)散膜進(jìn)入到接收液中，對(duì)測(cè)定產(chǎn)生干擾。本實(shí)驗(yàn)對(duì)HCO3-，CO32-的干擾情況進(jìn)行了考察。

在上述優(yōu)化的最佳實(shí)驗(yàn)條件下，以20 μg/mL的SO32-標(biāo)準(zhǔn)溶液作為測(cè)試溶液，在相對(duì)誤差±5%的允許范圍內(nèi)，NaHCO3，Na2CO3的允許倍數(shù)分別為150和20倍。

2.8 方法的分析性能

在選定的實(shí)驗(yàn)參數(shù)下，當(dāng)接收液流速V2為1.2 mL/min時(shí)，在1.0～5.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，吸光度差值與二氧化硫濃度呈線性響應(yīng)關(guān)系。線性回歸方程為：ΔA=0.031 4c+0.004 4(r=0.999 4，n=6)，其中c為二氧化硫濃度，ΔA為吸光度差值。以空白溶液吸光度的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差與標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率的比值作為方法的檢出限(3σ)，計(jì)算得檢出限為0.33 μg/mL。

當(dāng)接收液流速V2為4.2 mL/min時(shí)，在5.0～50.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，吸光度差值與二氧化硫濃度呈線性響應(yīng)關(guān)系。線性回歸方程為：ΔA=0.007 7c+0.0327(r=0.997 8，n=7)。連續(xù)11次重復(fù)一定濃度的樣品溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在0.29%～0.43%，精密度良好。

為了驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性，對(duì)兩種葡萄酒樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率考察。按實(shí)驗(yàn)中的操作方法，在兩種葡萄酒的進(jìn)樣量均為200 μL的條件下，分別測(cè)定其吸光度差值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中SO2的濃度。測(cè)定結(jié)果及加標(biāo)回收率見(jiàn)表1。

表1實(shí)際樣品加標(biāo)回收率

Table1Resultsofrecoverytest/(mg·L-1)

由表1可知，兩種葡萄酒樣品的加標(biāo)回收率在98.7%～104.7%(n=3)。

3 結(jié)語(yǔ)

實(shí)驗(yàn)首次提出單泵單閥式順序注射進(jìn)樣體系與氣體擴(kuò)散分離裝置聯(lián)用，基于在微堿性條件下，亞硫酸根離子可與孔雀綠溶液發(fā)生加成反應(yīng)并使其褪色的原理，測(cè)定了葡萄酒中二氧化硫的含量。流路簡(jiǎn)單，所使用的指示劑毒性小，不附著管路、易于沖洗，用于葡萄酒中二氧化硫的測(cè)定，取得比較滿意的結(jié)果。

[1] 尚云青,唐若瑩,俞捷,等.干紅葡萄酒中二氧化硫測(cè)定方法的比較研究[J].食品工程,2013(1):41-44.

[2] 方長(zhǎng)云,段彬伍,孫成效,等.充氮蒸餾-鹽酸副玫瑰苯胺比色法測(cè)定蔬菜及其制品中的亞硫酸鹽[J].食品科學(xué),2013,34(22):213-217.

[3] 彭曉俊,鄧愛(ài)華,龐晉山.高效液相色譜柱后衍生測(cè)定脫水蔬菜中的亞硫酸鹽[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2012,28(1):83-86.

[4] 孫艷平,李濤.頂空氣相色譜火焰光度檢測(cè)器檢測(cè)山藥中的二氧化硫[J].山西醫(yī)學(xué)雜志,2010,39(8):1024.

[5] 邵宏宏,周向陽(yáng),胡忠陽(yáng),等.離子色譜閥切換法測(cè)定硫磺熏蒸中藥材中的二氧化硫[J].中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué),2012,2(增刊):57-58.

[6] 彭月,李雪蓮,銀玲,等.熒光衍生法測(cè)定中藥二氧化硫殘留量研究[J].中國(guó)中藥雜志,2013,38(2):212-216.

[7] 張紅兵,胡云霞,連靠奇,等.滲透汽化流動(dòng)注射高錳酸鉀-羅丹明B化學(xué)發(fā)光法測(cè)定食品中的亞硫酸鹽[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2013,23(8):1846-1848,1851.

[8] 廖文生,劉中勇,趙群,等.鄰菲啰啉-Fe3+分光光度法測(cè)定食品中的亞硫酸鹽[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊,2012,22(3):39-41.

[9] 王夕云.順序注射光度分析法測(cè)定環(huán)境水中總有機(jī)碳和鉬的研究[D].沈陽(yáng):東北大學(xué),2008.

[10] 王夕云,陳志霞,范世華.順序注射催化光度分析法測(cè)定環(huán)境水樣中痕量鉬[J].中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué),2011,1(3):27-31.