徐坤等

摘要：建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器（FTsurface plasmon resonance，F(xiàn)TSPR）檢測食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結合的原理，將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結合到傳感器芯片上，通過溶液競爭法檢測檸檬黃。建立了標準曲線，獲得檢出限13 μg/L；研究了pH值對檢測的影響，得到pH 7.4為適宜的體系酸度；回收實驗、實際樣品檢測及干擾實驗的結果表明， 本方法對檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測方法相比較，F(xiàn)TSPR傳感器檢測檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢。

關鍵詞：表面等離子體共振傳感器； 檸檬黃； 小鼠單克隆抗體； 飲料

1引言

食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷，不易褪色，且價格較低而應用更廣泛。但是， 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結構的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說明迫切需要建立靈敏的檢測方法和手段。

檸檬黃是水溶性偶氮類合成色素，是被準許使用的最廣泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了諸多限制。2007年英國南安普敦大學發(fā)表了一份關于食用人工色素對兒童發(fā)育影響的研究結果，發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。隨后， 科學家們又對檸檬黃的危害進行進一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分別對雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃， 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關系，并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突變性[4]。針對檸檬黃過量使用的危害，已經建立的檢測方法有紫外可見光分光光度法[5，6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學法[10]等。這些方法雖得到了很好的應用效果，但存在著操作繁瑣、耗時長、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點。表面等離子體共振傳感器（SPR）作為一種選擇性好，靈敏度高，免標記，能夠實現(xiàn)實時、快速、在線檢測等優(yōu)點[11]，在食品安全方面得到了廣泛的應用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測了食物中的霉菌毒素，同時利用金納米擴大信號。本實驗采用SPR生物傳感器， 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測了實際樣品中的檸檬黃，并與紫外檢測的結果進行對比。 結果表明， SPR檢測對檸檬黃有較高的選擇性，并且檢出限（ng級）較低。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；FTSPR表面等離子體共振儀（美國Thermo公司）； RE52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。

檸檬黃（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巰基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亞胺鹽酸鹽（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羥基琥珀酰亞胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黃（>87%），胭脂紅（AR），蘇丹紅I（AR），以上試劑均為上海晶純試劑有限公司生產；小鼠檸檬黃單克隆抗體（北京瀚海生物試劑有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凱力達化工有限公司），鹽酸乙醇胺（AR，東京化成工業(yè)株式會社），磷酸鹽緩沖溶液（PBS），橙色飲料1和2購于市場。實驗用水為雙蒸水。

2.2實驗方法

2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測稱取檸檬黃0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，實驗中進一步稀釋。以PBS為參比，1 cm比色皿，在200～600 nm測定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測吸光度值，建立吸光度濃度的標準曲線。取適量橙色飲料1，在0 ℃， 12000 r/min離心30 min， 取上清液稀釋5倍備用。

2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見分光光度法檢測， 平行測定3次。根據文獻[15]， 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基，可通過中間物N羥琥珀酰亞胺（NHS）與蛋白質的氨基結合，形成蛋白質與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無色。將得到的TEBSA產物用紫外可見光分光光度法表征。

2.2.3SPR傳感器檢測檸檬黃 （1） 檢測方法采用溶液競爭法檢測檸檬黃：將分析物與對應的抗體混合，并流過固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變，這樣響應信號與分析物濃度成正比。因為抗體會帶著結合上的分析物再次結合到固定在傳感器表面的分析物上，因此響應信號會放大。當平衡量的分析物和抗體混合時，只有未與分析物結合的抗體才會與傳感器表面的分析物結合，因此響應信號與分析物濃度成反比關系。首先將MPA鍵合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上，利用溶液競爭法檢測檸檬黃。（2） SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液（30% H2O2濃H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水沖洗，再用氮氣吹干。將干凈的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復沖洗，再將芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水沖洗，再將芯片轉入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水沖洗后，用氮氣吹干備用。在室溫下，將芯片放入預先配置好的洗液中浸泡10 min中，將芯片表面的結合物清除，浸泡過程中需要振蕩3～5次。取出后用水沖洗，氮氣吹干備用。

2.2.4FTSPR傳感器檢測檸檬黃將處理過的芯片安裝入儀器，設定參數(shù)，PBS緩沖溶液作為流動緩沖液（所有實驗用試液經0.45 μm孔徑膜過濾和超聲脫氣處理），流速固定為1.20 mL/min，采集背景。背景采集完畢后，固定流速為0.2 mL/min，得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過流動泵將系列處理過的檸檬黃溶液引入流動池中，與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸，自由抗體就會與芯片上的偶聯(lián)物結合，F(xiàn)TSPR實時記錄的波數(shù)變化達到穩(wěn)定時，再通入PBS至信號穩(wěn)定。

2.2.5樣品準備及檢測用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液，根據所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量（一般按抗體與檸檬黃1∶1混合），保證抗體相對于待測物是過量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體，經孵育處理后，通入FTSPR傳感器。

分別取50 mL橙色飲料1和2， 用旋蒸器將水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，備用。稀釋至適宜倍數(shù)，進行檢測，分別平行測定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液，用橙色飲料1稀釋后，經孵育處理，通入FTSPR傳感器檢測，平行測定3次。

3結果與討論

3.1紫外光譜檢測檸檬黃結果分析

由圖1可見，檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰，在200 nm處有半吸收峰，426 nm為主吸收峰。 通過線性擬合得線性方程為A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作為樣品中檸檬黃檢測的依據。基于信噪比為3，得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

利用標準曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L， 換算后為0.02 g/kg，低于食品添加劑使用衛(wèi)生標準（GB27602007）[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

摘要：建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器（FTsurface plasmon resonance，F(xiàn)TSPR）檢測食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結合的原理，將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結合到傳感器芯片上，通過溶液競爭法檢測檸檬黃。建立了標準曲線，獲得檢出限13 μg/L；研究了pH值對檢測的影響，得到pH 7.4為適宜的體系酸度；回收實驗、實際樣品檢測及干擾實驗的結果表明， 本方法對檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測方法相比較，F(xiàn)TSPR傳感器檢測檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢。

關鍵詞：表面等離子體共振傳感器； 檸檬黃； 小鼠單克隆抗體； 飲料

1引言

食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷，不易褪色，且價格較低而應用更廣泛。但是， 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結構的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說明迫切需要建立靈敏的檢測方法和手段。

檸檬黃是水溶性偶氮類合成色素，是被準許使用的最廣泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了諸多限制。2007年英國南安普敦大學發(fā)表了一份關于食用人工色素對兒童發(fā)育影響的研究結果，發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。隨后， 科學家們又對檸檬黃的危害進行進一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分別對雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃， 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關系，并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突變性[4]。針對檸檬黃過量使用的危害，已經建立的檢測方法有紫外可見光分光光度法[5，6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學法[10]等。這些方法雖得到了很好的應用效果，但存在著操作繁瑣、耗時長、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點。表面等離子體共振傳感器（SPR）作為一種選擇性好，靈敏度高，免標記，能夠實現(xiàn)實時、快速、在線檢測等優(yōu)點[11]，在食品安全方面得到了廣泛的應用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測了食物中的霉菌毒素，同時利用金納米擴大信號。本實驗采用SPR生物傳感器， 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測了實際樣品中的檸檬黃，并與紫外檢測的結果進行對比。 結果表明， SPR檢測對檸檬黃有較高的選擇性，并且檢出限（ng級）較低。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；FTSPR表面等離子體共振儀（美國Thermo公司）； RE52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。

檸檬黃（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巰基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亞胺鹽酸鹽（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羥基琥珀酰亞胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黃（>87%），胭脂紅（AR），蘇丹紅I（AR），以上試劑均為上海晶純試劑有限公司生產；小鼠檸檬黃單克隆抗體（北京瀚海生物試劑有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凱力達化工有限公司），鹽酸乙醇胺（AR，東京化成工業(yè)株式會社），磷酸鹽緩沖溶液（PBS），橙色飲料1和2購于市場。實驗用水為雙蒸水。

2.2實驗方法

2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測稱取檸檬黃0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，實驗中進一步稀釋。以PBS為參比，1 cm比色皿，在200～600 nm測定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測吸光度值，建立吸光度濃度的標準曲線。取適量橙色飲料1，在0 ℃， 12000 r/min離心30 min， 取上清液稀釋5倍備用。

2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見分光光度法檢測， 平行測定3次。根據文獻[15]， 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基，可通過中間物N羥琥珀酰亞胺（NHS）與蛋白質的氨基結合，形成蛋白質與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無色。將得到的TEBSA產物用紫外可見光分光光度法表征。

2.2.3SPR傳感器檢測檸檬黃 （1） 檢測方法采用溶液競爭法檢測檸檬黃：將分析物與對應的抗體混合，并流過固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變，這樣響應信號與分析物濃度成正比。因為抗體會帶著結合上的分析物再次結合到固定在傳感器表面的分析物上，因此響應信號會放大。當平衡量的分析物和抗體混合時，只有未與分析物結合的抗體才會與傳感器表面的分析物結合，因此響應信號與分析物濃度成反比關系。首先將MPA鍵合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上，利用溶液競爭法檢測檸檬黃。（2） SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液（30% H2O2濃H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水沖洗，再用氮氣吹干。將干凈的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復沖洗，再將芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水沖洗，再將芯片轉入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水沖洗后，用氮氣吹干備用。在室溫下，將芯片放入預先配置好的洗液中浸泡10 min中，將芯片表面的結合物清除，浸泡過程中需要振蕩3～5次。取出后用水沖洗，氮氣吹干備用。

2.2.4FTSPR傳感器檢測檸檬黃將處理過的芯片安裝入儀器，設定參數(shù)，PBS緩沖溶液作為流動緩沖液（所有實驗用試液經0.45 μm孔徑膜過濾和超聲脫氣處理），流速固定為1.20 mL/min，采集背景。背景采集完畢后，固定流速為0.2 mL/min，得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過流動泵將系列處理過的檸檬黃溶液引入流動池中，與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸，自由抗體就會與芯片上的偶聯(lián)物結合，F(xiàn)TSPR實時記錄的波數(shù)變化達到穩(wěn)定時，再通入PBS至信號穩(wěn)定。

2.2.5樣品準備及檢測用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液，根據所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量（一般按抗體與檸檬黃1∶1混合），保證抗體相對于待測物是過量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體，經孵育處理后，通入FTSPR傳感器。

分別取50 mL橙色飲料1和2， 用旋蒸器將水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，備用。稀釋至適宜倍數(shù)，進行檢測，分別平行測定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液，用橙色飲料1稀釋后，經孵育處理，通入FTSPR傳感器檢測，平行測定3次。

3結果與討論

3.1紫外光譜檢測檸檬黃結果分析

由圖1可見，檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰，在200 nm處有半吸收峰，426 nm為主吸收峰。 通過線性擬合得線性方程為A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934?？梢宰鳛闃悠分袡幟庶S檢測的依據?；谛旁氡葹?，得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

利用標準曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L， 換算后為0.02 g/kg，低于食品添加劑使用衛(wèi)生標準（GB27602007）[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。

摘要：建立了傅里葉表面等離子體共振傳感器（FTsurface plasmon resonance，F(xiàn)TSPR）檢測食品色素檸檬黃的方法。利用檸檬黃與檸檬黃小鼠單克隆抗體特異性結合的原理，將碳酰二亞胺鹽酸鹽法制備出的檸檬黃牛血清白蛋白偶聯(lián)物成功結合到傳感器芯片上，通過溶液競爭法檢測檸檬黃。建立了標準曲線，獲得檢出限13 μg/L；研究了pH值對檢測的影響，得到pH 7.4為適宜的體系酸度；回收實驗、實際樣品檢測及干擾實驗的結果表明， 本方法對檸檬黃有高選擇性。與紫外檢測方法相比較，F(xiàn)TSPR傳感器檢測檸檬黃方法表現(xiàn)出了選擇性高和檢出限低等優(yōu)勢。

關鍵詞：表面等離子體共振傳感器； 檸檬黃； 小鼠單克隆抗體； 飲料

1引言

食品色素廣泛用于日常食品中。 合成色素由于顏色更加鮮艷，不易褪色，且價格較低而應用更廣泛。但是， 合成色素中多含有RNNR鍵、苯環(huán)或氧雜蒽結構的化合物，使其安全性降低，使用受到限制。近幾年由色素引發(fā)的食品安全事件都說明迫切需要建立靈敏的檢測方法和手段。

檸檬黃是水溶性偶氮類合成色素，是被準許使用的最廣泛的色素之一[1]，但是因其安全性， 使用量也受到了諸多限制。2007年英國南安普敦大學發(fā)表了一份關于食用人工色素對兒童發(fā)育影響的研究結果，發(fā)現(xiàn)包括酒石黃和日落黃在內的7種人工色素可能會使兒童智商下降5分。隨后， 科學家們又對檸檬黃的危害進行進一步的研究，Kamel[2]和Soltan[3]分別對雄性威斯塔老鼠和小白鼠喂食檸檬黃， 發(fā)現(xiàn)檸檬黃與多動癥、焦慮、沮喪等行為有直接因果關系，并使小鼠的肝臟和腎臟組織發(fā)生改變。 高濃度檸檬黃能使雄性小鼠精子畸形率增加，有一定的致突變性[4]。針對檸檬黃過量使用的危害，已經建立的檢測方法有紫外可見光分光光度法[5，6]、熒光光譜法[7]、酶免疫聯(lián)法[8]、高效液相色譜法[9]、電化學法[10]等。這些方法雖得到了很好的應用效果，但存在著操作繁瑣、耗時長、用量大、靈敏度較低、特異性差等諸多缺點。表面等離子體共振傳感器（SPR）作為一種選擇性好，靈敏度高，免標記，能夠實現(xiàn)實時、快速、在線檢測等優(yōu)點[11]，在食品安全方面得到了廣泛的應用。Fernndez等[12]利用多通道SPR傳感器在線監(jiān)測了牛奶中的恩諾沙星、磺胺嘧啶、氯霉素等抗生素。Li等[13]利用SPR傳感器檢測了食物中的霉菌毒素，同時利用金納米擴大信號。本實驗采用SPR生物傳感器， 利用抗原抗體相互作用的原理[14]檢測了實際樣品中的檸檬黃，并與紫外檢測的結果進行對比。 結果表明， SPR檢測對檸檬黃有較高的選擇性，并且檢出限（ng級）較低。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

UV2450紫外可見分光光度計（日本島津公司）；FTSPR表面等離子體共振儀（美國Thermo公司）； RE52AA旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；TGL20M高速臺式冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；KQ200KD型高功率數(shù)控超聲波清洗儀器（昆山市超聲儀器有限公司），透析袋（27 mm，USA）。

檸檬黃（Tartrazine，TE，95%），牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA，AR），巰基丙酸（Thiohydracrylic acid， MPA， AR），碳酰二亞胺鹽酸鹽（1Ethyl（3dimethyl aminopropyl）carbodiimide，EDC，98%），N羥基琥珀酰亞胺（NHydroxysuccinimide，NHS，AR），日落黃（>87%），胭脂紅（AR），蘇丹紅I（AR），以上試劑均為上海晶純試劑有限公司生產；小鼠檸檬黃單克隆抗體（北京瀚海生物試劑有限公司）， N，N二甲基甲酰胺（AR，天津市凱力達化工有限公司），鹽酸乙醇胺（AR，東京化成工業(yè)株式會社），磷酸鹽緩沖溶液（PBS），橙色飲料1和2購于市場。實驗用水為雙蒸水。

2.2實驗方法

2.2.1檸檬黃的紫外光譜檢測稱取檸檬黃0.05 g，用PBS（0.02 mol/L）配成0.5 g/mL溶液，實驗中進一步稀釋。以PBS為參比，1 cm比色皿，在200～600 nm測定吸收光譜。配制一系列濃度梯度在λmax處測吸光度值，建立吸光度濃度的標準曲線。取適量橙色飲料1，在0 ℃， 12000 r/min離心30 min， 取上清液稀釋5倍備用。

2.2.2制備檸檬黃半抗原采用紫外可見分光光度法檢測， 平行測定3次。根據文獻[15]， 利用EDC法將檸檬黃與牛血清白蛋白進行偶聯(lián)。因檸檬黃分子中含有羧基，可通過中間物N羥琥珀酰亞胺（NHS）與蛋白質的氨基結合，形成蛋白質與小分子的偶聯(lián)物。得到的偶聯(lián)物用透析袋純化至透析液為無色。將得到的TEBSA產物用紫外可見光分光光度法表征。

2.2.3SPR傳感器檢測檸檬黃 （1） 檢測方法采用溶液競爭法檢測檸檬黃：將分析物與對應的抗體混合，并流過固定分析物的傳感器表面。保證抗體的量固定不變，這樣響應信號與分析物濃度成正比。因為抗體會帶著結合上的分析物再次結合到固定在傳感器表面的分析物上，因此響應信號會放大。當平衡量的分析物和抗體混合時，只有未與分析物結合的抗體才會與傳感器表面的分析物結合，因此響應信號與分析物濃度成反比關系。首先將MPA鍵合到芯片上，再用EDC/NHS活化羧基，然后將TEBSA偶聯(lián)物鍵合到芯片上，利用溶液競爭法檢測檸檬黃。（2） SPR傳感器制備及再生在室溫下將金片放入新配洗液（30% H2O2濃H2SO4，3∶7， V/V）中清洗2～3 min，取出用大量水沖洗，再用氮氣吹干。將干凈的芯片放入10 mmol/L MPA溶液中，在4 ℃下放置12 h。取出用大量乙醇和水反復沖洗，再將芯片放入EDC（0.2 mol/L）/NHS（0.05 mol/L）中活化1 h。取出用大量水沖洗，再將芯片轉入TEBSA溶液（0.1 g/L，pH=7.4）中浸泡12 h，取出用水沖洗后，用氮氣吹干備用。在室溫下，將芯片放入預先配置好的洗液中浸泡10 min中，將芯片表面的結合物清除，浸泡過程中需要振蕩3～5次。取出后用水沖洗，氮氣吹干備用。

2.2.4FTSPR傳感器檢測檸檬黃將處理過的芯片安裝入儀器，設定參數(shù)，PBS緩沖溶液作為流動緩沖液（所有實驗用試液經0.45 μm孔徑膜過濾和超聲脫氣處理），流速固定為1.20 mL/min，采集背景。背景采集完畢后，固定流速為0.2 mL/min，得到穩(wěn)定的FTSPR基線。再通過流動泵將系列處理過的檸檬黃溶液引入流動池中，與固定在芯片上的TEBSA偶聯(lián)物的傳感器表面接觸，自由抗體就會與芯片上的偶聯(lián)物結合，F(xiàn)TSPR實時記錄的波數(shù)變化達到穩(wěn)定時，再通入PBS至信號穩(wěn)定。

2.2.5樣品準備及檢測用PBS配制系列梯度濃度的檸檬黃溶液，根據所配樣品的最大濃度選擇所需要的抗體量（一般按抗體與檸檬黃1∶1混合），保證抗體相對于待測物是過量的。不同濃度檸檬黃溶液中加入相同量的抗體，經孵育處理后，通入FTSPR傳感器。

分別取50 mL橙色飲料1和2， 用旋蒸器將水分全部蒸干，用PBS定容至100 mL，備用。稀釋至適宜倍數(shù)，進行檢測，分別平行測定3次。取適量500 μg/L檸檬黃溶液，用橙色飲料1稀釋后，經孵育處理，通入FTSPR傳感器檢測，平行測定3次。

3結果與討論

3.1紫外光譜檢測檸檬黃結果分析

由圖1可見，檸檬黃在426和257 nm處有吸收峰，在200 nm處有半吸收峰，426 nm為主吸收峰。 通過線性擬合得線性方程為A=59.3286c （g/L）+0.0421， R2=0.9934。可以作為樣品中檸檬黃檢測的依據。基于信噪比為3，得出方法的檢出限為0.17 mg/L。

利用標準曲線可得橙色飲料1中檸檬黃含量為21.7 mg/L， 換算后為0.02 g/kg，低于食品添加劑使用衛(wèi)生標準（GB27602007）[16]規(guī)定檸檬黃在飲料中最大使用量0.1 g/kg。