魏長龍，趙樹欣，王 珊，史吉平，張保國，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210）

Nocardia canicruria BF313催化甾體9α-羥基化發(fā)酵工藝優(yōu)化

魏長龍1，2，趙樹欣1，王 珊1，2，史吉平2，張保國2，*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國科學(xué)院上海高等研究院，上海201210）

應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化的方法，以Nocardia canicruria BF313作為實(shí)驗(yàn)菌株，雄烯二酮為底物，研究了生物法制備9α-羥基雄烯二酮的新工藝。實(shí)驗(yàn)考察了轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基成分、投料方式、初始pH等因素對(duì)微生物轉(zhuǎn)化生成9α-羥基雄烯二酮的影響。最終確定的發(fā)酵培養(yǎng)基為：15g/L葡萄糖，2g/L蛋白胨，5g/L酵母粉，1.5g/L硫酸亞鐵。滅菌前調(diào)pH為7.0，以4%的接種量接種，預(yù)培養(yǎng)16h后以擬結(jié)晶方式投加底物，經(jīng)過48h的轉(zhuǎn)化，在投料濃度為10g/L情況下，底物轉(zhuǎn)化率可高達(dá)97.2%，在投料濃度20g/L情況下，底物轉(zhuǎn)化率也可達(dá)82.7%，投料濃度高于國際水平10g/L，具有極好的產(chǎn)業(yè)化前景。

微生物轉(zhuǎn)化，雄甾-4-烯-3，17-雙酮，9α-羥基化，發(fā)酵條件，優(yōu)化

甾體藥物作為僅次于抗生素的第二大藥物，人們對(duì)其的需求量不斷增加[1]。目前，以生物轉(zhuǎn)化方法催化合成甾體藥物越來越受到重視，相較于傳統(tǒng)化學(xué)合成方法，生物轉(zhuǎn)化具有產(chǎn)率高、專一性強(qiáng)、條件較溫和且環(huán)境友好等多種優(yōu)勢(shì)，使其逐漸成為醫(yī)藥工業(yè)合成甾體藥物的先進(jìn)技術(shù)手段[1-4]。雄烯二酮全稱雄甾-4-烯-3，17-二酮（Androstenedione，4-AD）是合成甾體激素類藥物的關(guān)鍵中間體，其可由植物甾醇經(jīng)微生物降解得到，常被用于制備內(nèi)分泌激素、避孕藥及心血管藥物等，在其甾體母核上引入羥基后可大大增強(qiáng)其抗炎活性[2-3]。9α-羥基雄烯二酮（9α-OH-AD）是一種甾體工業(yè)化生產(chǎn)中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物，在甾體工業(yè)化生產(chǎn)中起著重要作用。利用9α-OHAD作為前體物可以合成氫化可的松、17α-OH黃體酮、依普利酮、β米松、地塞米松、可的松等多種重要的甾體原料藥，具有重要的商業(yè)價(jià)值[5]。目前，國內(nèi)對(duì)9α-OH-AD的合成都是從4-AD出發(fā)，通過多步化學(xué)合成得到，反應(yīng)過程中存在著化學(xué)工藝過程復(fù)雜、步驟繁瑣、累積產(chǎn)率低、產(chǎn)物成本高、底物消耗大等一系列問題。微生物轉(zhuǎn)化是指利用微生物細(xì)胞對(duì)有機(jī)化合物某一特定部位（基團(tuán)）的作用，使它轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)上相類似的另一種化合物[2]。近年來，利用微生物對(duì)不同甾體類化合物的轉(zhuǎn)化技術(shù)得到充分發(fā)展并在工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用[4]。而利用微生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)9α-OH-AD的內(nèi)容在國內(nèi)外卻鮮有報(bào)道。本研究通過微生物轉(zhuǎn)化方法，以Nocardia canicruria BF313作為實(shí)驗(yàn)菌種，4-AD為底物，通過對(duì)培養(yǎng)條件和轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化最終大大提高了轉(zhuǎn)化效率，為進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Nocardia canicruria BF313 本研究室自主篩選后鑒定保存；雄烯二酮 HPLC純度99.45%，常州佳爾科藥業(yè)集團(tuán)；酵母膏、麥芽浸膏、葡萄糖、可溶性淀粉、蛋白胨、酵母粉等有機(jī)碳氮源 上海生工生物工程有限公司；KH2PO4、MgSO4、（NH4）2SO4、KNO3、甲醇、乙醇等化學(xué)試劑 均為分析純，國藥集團(tuán)（上海）化學(xué)試劑有限公司；平板培養(yǎng)基 酵母膏4g，麥芽浸膏10g，葡萄糖4g，瓊脂2%，定容到1L，pH 7.0；種子培養(yǎng)基 酵母膏4g，麥芽浸膏10g，葡萄糖4g，定容到1L，pH 7.0；初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，KH2PO42.5g/L，MgSO41.5g/L，pH7.0。

RID-10A/SPD-20A型高效液相色譜儀 日本SHIMADZU；PB-10型pH計(jì) 德國Sartorius；BSA 224SCW型電子天平 德國Sartorius；DU730型紫外分光光度計(jì) 德國Beckman；BX51型顯微鏡 日本OLYMPUS；ZHWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公；KS-RD-1型熔點(diǎn)測(cè)試儀 東莞市金石檢測(cè)儀器有限公司；Bruker AMX-400型核磁共振儀、Bruker maxis UHR-TOF型質(zhì)譜儀 德國Brucker公司。

1.2 微生物培養(yǎng)及初始甾體轉(zhuǎn)化條件

種子培養(yǎng)：平板劃線培養(yǎng)菌株，于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30h后，挑取單克隆接種于種子培養(yǎng)基中，30℃，200r/m in搖床中培養(yǎng)24h。初始甾體轉(zhuǎn)化條件：在250m L擋板瓶中裝液50m L，調(diào)初始pH為7.0，隨后以8%的接種量接入種子液，放置于30℃，200r/m in的搖床中預(yù)培養(yǎng)24h后，投加甲醇溶解的濃度為10g/L的底物4-AD進(jìn)行發(fā)酵轉(zhuǎn)化。基于上述反應(yīng)條件對(duì)培養(yǎng)基各成分進(jìn)行優(yōu)化，每隔12h取樣測(cè)定甾體轉(zhuǎn)化率。

1.3 發(fā)酵優(yōu)化方法

1.3.1 培養(yǎng)基優(yōu)化 參考文獻(xiàn)[6]的方法。投加4-AD濃度：10g/L。碳源優(yōu)化：分別以10g/L的葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露糖替代初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的葡萄糖，其他初始培養(yǎng)基成分不變，以初始轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。氮源優(yōu)化：分別以5g/L的蛋白胨、玉米干粉、酵母粉、黃豆粉、（NH4）2SO4、KNO3替代初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的蛋白胨，其他初始培養(yǎng)基成分不變，以初始轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。金屬離子優(yōu)化：分別以1.5g/L的硫酸鎂、硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸銅、氯化鈣、氯化鈷替代初始轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的硫酸鎂，其他初始培養(yǎng)基成分不變，以初始轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。正交實(shí)驗(yàn)[7]：以甾體轉(zhuǎn)化率作為判定指標(biāo)，選取優(yōu)化好的培養(yǎng)基成分葡萄糖、酵母粉、蛋白胨、硫酸亞鐵四種因素并以三種不同濃度為水平進(jìn)行L9（34）正交實(shí)驗(yàn)，正交實(shí)驗(yàn)各因子水平如表1所示。

表1 因子與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化 投加4-AD濃度：20g/L。初始pH優(yōu)化：利用氫氧化鈉將最優(yōu)培養(yǎng)基的初始pH調(diào)節(jié)為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他初始轉(zhuǎn)化條件不變，觀察隨pH升高甾體轉(zhuǎn)化率的變化情況。接種量?jī)?yōu)化：分別以2%、4%、8%、12%、16%的接種量將種子液接種到最優(yōu)培養(yǎng)基中，其他初始轉(zhuǎn)化條件不變，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。預(yù)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化：以優(yōu)化好的接種量接種到最優(yōu)培養(yǎng)基中，分別預(yù)培養(yǎng)4、8、12、16、20、24h后投料，投料前取樣測(cè)定其生物量，其他初始轉(zhuǎn)化條件不變，觀察不同預(yù)培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)生物量與甾體轉(zhuǎn)化率的對(duì)應(yīng)關(guān)系。投料方式優(yōu)化：分別以底物干粉、溶解于有機(jī)溶劑（甲醇、DMSO、乙醇、吐溫80）及擬結(jié)晶（方法見參考文獻(xiàn)[8]實(shí)驗(yàn)方法）等方式投料，其他初始轉(zhuǎn)化條件不變，探究不同投料方式對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。

1.3.3 菌種轉(zhuǎn)化能力驗(yàn)證 利用優(yōu)化好的培養(yǎng)基、發(fā)酵條件分別投加10、15、20、25g/L的4-AD，測(cè)定其在不同時(shí)間點(diǎn)轉(zhuǎn)化率的變化情況。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 菌體生物量的測(cè)定 采用Beckman Coulter分光光度計(jì)，以無菌發(fā)酵培養(yǎng)液OD600值作為對(duì)照，在0～ 24h間每隔4h的測(cè)定菌液的OD600值，以O(shè)D600值來表示菌體在此時(shí)刻的生物量。

1.4.2 甾體轉(zhuǎn)化率的測(cè)定 采用薄層層析（TLC）檢測(cè)法。將底物4-AD，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定后的產(chǎn)物9α-OH-AD標(biāo)品及轉(zhuǎn)化后的樣品在硅膠預(yù)制板上點(diǎn)樣，展開劑為體積比4∶1的苯丙酮，254nm紫外燈下顯色。高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)法：采用C18反相層析柱（Agilent Extend-C18，4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相為70%甲醇：30%水（v/v），流速為1.0m L/m in；柱溫為32℃；紫外檢測(cè)波長為254nm；進(jìn)樣體積為20μL。甾體轉(zhuǎn)化率的計(jì)算如下：甾體轉(zhuǎn)化率（%）=（產(chǎn)物9α-OH-AD峰面積/投加底物4-AD峰面積）×100。

1.4.3 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的鑒定 將發(fā)酵液用乙酸乙酯反復(fù)萃取三次，取乙酸乙酯層置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)除去溶劑，再經(jīng)冰甲醇重結(jié)晶后采用熔點(diǎn)、NMR和質(zhì)譜鑒定產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)[9]。熔點(diǎn)測(cè)定：取產(chǎn)物晶體適量放入鋁皿中利用熔點(diǎn)測(cè)試儀KS-RD-1測(cè)定其熔點(diǎn)，升溫速率為3℃/m in，升溫范圍為25～250℃。NMR參數(shù)：以CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo)，觀測(cè)頻率為400.13MHz，實(shí)驗(yàn)溫度為300.4K。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離能量70eV，連接管溫度280℃，掃描范圍70～1000m/z；進(jìn)樣量1.0μL。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0處理軟件分析，正交實(shí)驗(yàn)中甾體轉(zhuǎn)化率的表示方式為±s，n=3。

2 結(jié)果與分析

2.1 Nocardia canicruria BF313轉(zhuǎn)化能力的薄層初篩

薄層層析結(jié)果見圖1，通過樣品與標(biāo)品位置的比照，可判斷有無副產(chǎn)物產(chǎn)生，根據(jù)斑點(diǎn)大小及顏色深淺可定性判定其轉(zhuǎn)化情況。由圖1可知，轉(zhuǎn)化體系是比較專一的，幾乎無其他副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

圖1 甾體底物及產(chǎn)物薄層層析（TLC）檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The results of substrate and product by thin layer chromatography（TLC）

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基各成分的優(yōu)化

2.2.1 最佳碳源的優(yōu)化 碳源可以為微生物生長代謝提供細(xì)胞碳架，是微生物生長及轉(zhuǎn)化甾體的物質(zhì)基礎(chǔ)及能量來源。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖2）可知，五種碳源均可被諾卡式菌利用來生長及轉(zhuǎn)化底物，但從效果來看，經(jīng)過48h的轉(zhuǎn)化，葡萄糖作為碳源的轉(zhuǎn)化率為57.7%，遠(yuǎn)高于其他碳源，故選擇葡萄糖為最優(yōu)碳源。

圖2 不同碳源對(duì)甾體轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of different carbon sources on steroids’transformation

2.2.2 最佳氮源的優(yōu)化 氮源作為構(gòu)成生物體的蛋白質(zhì)、核酸及其他氮素化合物的材料，是微生物細(xì)胞生長及生命活動(dòng)所必不可少的。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3）可知，有機(jī)氮源的轉(zhuǎn)化效果要遠(yuǎn)好于無機(jī)氮源，四種有機(jī)氮源中，酵母粉作為氮源的轉(zhuǎn)化率最高，48h內(nèi)達(dá)到61.3%，另外蛋白胨作為生長因子可促進(jìn)菌體的生長，所以選擇酵母粉和蛋白胨（質(zhì)量比1∶1）為培養(yǎng)基的氮源。

2.2.3 最佳金屬離子的優(yōu)化 據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[10]，金屬二價(jià)陽離子的存在可大幅影響甾體的轉(zhuǎn)化率，這可能是由于金屬離子激發(fā)了電子的傳遞，促進(jìn)或抑制了分子酶間的相互作用，從而影響了酶對(duì)底物的催化。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）可知，與Mg2+相比，F(xiàn)e2+、Ca2+促進(jìn)了底物的轉(zhuǎn)化，而Co2+、Cu2+則大幅降低了轉(zhuǎn)化率，其中Fe2+的轉(zhuǎn)化效果最好，故選擇硫酸亞鐵作為培養(yǎng)基金屬離子來源。

圖3 不同氮源對(duì)甾體轉(zhuǎn)化率的影響Fig.3 Effectof different nitrogen sources on steroids’transformation

2.2.4培養(yǎng)基各成分配比的正交實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)各實(shí)驗(yàn)因子極差分析（表2）可以得出，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響最大的為葡萄糖，影響最小的為硫酸亞鐵。最終得到的最優(yōu)培養(yǎng)基為A3B1C2D2，即葡萄糖15g/L，蛋白胨2g/L，酵母粉5g/L，硫酸亞鐵1.5g/L，磷酸二氫鉀2.5g/L。以此培養(yǎng)基發(fā)酵轉(zhuǎn)化4-AD，48h后甾體轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.2%，高于正交實(shí)驗(yàn)其他方案及初始培養(yǎng)基。

2.3 發(fā)酵反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 最適初始pH的優(yōu)化 pH可通過影響菌體胞內(nèi)酶的活性顯著影響微生物對(duì)底物的轉(zhuǎn)化，由圖5可以看出，初始pH 6.5～7.5為微生物轉(zhuǎn)化的最適范圍，其中pH為7.0時(shí)轉(zhuǎn)化率最高，故確定培養(yǎng)基的初始pH為7.0。

圖5 不同初始pH對(duì)甾體轉(zhuǎn)化率的影響Fig.5 Effectof different initial pH value on steroids’transformation

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果及最優(yōu)方案Table 2 Orthogonal test results and the optimal case

2.3.2 最佳接種量的優(yōu)化 接種量的不同可顯著影響微生物胞內(nèi)酶對(duì)甾體的催化，接種量過低使得菌體生長點(diǎn)不足，從而導(dǎo)致用于轉(zhuǎn)化的酶量不足；反之接種量過高，則會(huì)導(dǎo)致酶活力降低，同樣抑制轉(zhuǎn)化率的提高。由圖6可知，接種量為4%時(shí)甾體轉(zhuǎn)化率達(dá)到68.6%，為最適宜的菌液接種量。

2.3.3 微生物預(yù)培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化 在微生物的不同生長時(shí)期投料，由于菌體酶活力及酶數(shù)量的不同，從而顯著影響微生物對(duì)甾體的轉(zhuǎn)化。從圖7可以看出，預(yù)培養(yǎng)16h時(shí)，菌體生物量經(jīng)過對(duì)數(shù)期的迅猛增加達(dá)到最高值，菌體酶數(shù)量與酶活力到達(dá)最適平衡點(diǎn)，此時(shí)甾體轉(zhuǎn)化率最高。

2.3.4 底物投料方式的優(yōu)化 甾體物質(zhì)不溶于水，需先溶于其他溶劑后在投料有利于底物進(jìn)入菌體細(xì)胞內(nèi)完成轉(zhuǎn)化。由圖8可知，以干粉作為對(duì)照，其他投料方式均明顯提高了轉(zhuǎn)化效果，其中以最優(yōu)的擬結(jié)晶方式投料后，底物轉(zhuǎn)化率提升最快為82.7%。

圖8 投料方式不同對(duì)甾體轉(zhuǎn)化率的影響Fig.8 Effect of different feed mode on steroids’transformation

2.4 菌種轉(zhuǎn)化能力驗(yàn)證及發(fā)酵過程中轉(zhuǎn)化率變化規(guī)律

由圖9各曲線變化趨勢(shì)可知，甾體轉(zhuǎn)化率達(dá)到一個(gè)最高值后隨孵化時(shí)間的增加略有下降且濃度越高其達(dá)到最高值所需的孵化時(shí)間也越長，最終得出的菌種轉(zhuǎn)化能力為：4-AD濃度為10g/L和15g/L時(shí)基本可實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化，分別達(dá)到97.2%及95.3%，濃度達(dá)到20g/L時(shí)轉(zhuǎn)化率也達(dá)82.7%，均體現(xiàn)出很高的轉(zhuǎn)化能力。

3 結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)篩選了碳氮源、金屬離子等培養(yǎng)基成分，并利用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化了初始pH，接種量以及預(yù)培養(yǎng)時(shí)間等培養(yǎng)條件，并對(duì)已報(bào)道過的多種投料方式的優(yōu)劣進(jìn)行了驗(yàn)證，最終獲得最適的培養(yǎng)基組成及最佳的培養(yǎng)條件。其中對(duì)金屬離子的篩選進(jìn)一步論證了不同離子對(duì)轉(zhuǎn)化酶運(yùn)行機(jī)制的影響，有助于抑制微生物對(duì)產(chǎn)物降解方面的研究。

Optim ization of submerged fermentation condition for 9α-hydroxylation of Steroid catalyzed by Nocardia canicruria BF313

WEIChang-long1，2，ZHAO Shu-xin1，WANG Shan1，2，SHIJi-ping2，ZHANG Bao-guo2，*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Shanghai Advanced Research Institute，Chinese Academy of Sciences，Shanghai201210，China）

Screened the fermentation med ium for 9α-hyd roxylation of and rostened ione catalyzed by Nocard ia canic ruria BF313，and the reaction conditions，such as feeding mode，the initialpH were op tim ized，the fermentation medium was finalized：15g/L g lucose，2g/L pep tone，5g/L yeast extract，1.5g/L FeSO4.Ad justed to pH7.0 before sterilization，then inoculated w ith 4%of the inoculum，added the substrate w ith Pseudo-crystallo mode after 16h p re-culture.48h after conversion，the substrate conversion rate was 97.2%when the concentration of the feed ing was 10g/L.Under the feeding concentration 20g/L，the substrate conversion rate could reach 82.7%. Conversion efficiency wasmuch higher than the international level，so the industrial p rospects would be great.

m icrobial transformation；and rostenedione；9α-hyd roxylation；fermentation cond ition；op tim ization

Q939．97

B

1002-0306（2014）18-0320-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.18.063

2014－01－03 *通訊聯(lián)系人

魏長龍（1987-），男，碩士研究生，研究方向：甾體藥物微生物轉(zhuǎn)化。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（41106125）。