姜福義，章廣玲

(1.河北聯(lián)合大學，河北唐山 063000;2.承德醫(yī)學院)

軟肝沖劑抗大鼠肝纖維化的實驗研究

姜福義1、2，章廣玲1△

(1.河北聯(lián)合大學，河北唐山 063000;2.承德醫(yī)學院)

目的:探討軟肝沖劑對大鼠肝纖維化模型的治療作用。方法:50只雄性Wistar大鼠隨機分為正常對照組、模型組、軟肝沖劑低劑量組(4g/kg/d)、軟肝沖劑高劑量組(8g/kg/d)和鱉甲軟肝片組(0.8g/kg/d)，每組10只大鼠。40%四氯化碳和40%酒精灌胃制備大鼠肝纖維化模型，各用藥組大鼠給予相應(yīng)藥物灌胃8周。分別檢測各組大鼠的肝功能，肝纖維化指標層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)和肝組織羥脯氨酸(HYP)的含量。結(jié)果:軟肝沖劑可明顯改善肝纖維化大鼠模型的肝功能，降低LN、HA和肝組織HYP的含量;并且，軟肝沖劑高劑量的效果明顯優(yōu)于軟肝沖劑低劑量和鱉甲軟肝片。結(jié)論:軟肝沖劑對肝纖維化大鼠模型具有較好的治療效果，但具體機制尚待進一步研究。

軟肝沖劑;肝纖維化;肝功能;羥脯氨酸

肝損傷后細胞外基質(zhì)沉積和降解失衡導致了肝纖維化[1]。目前，臨床上尚無確切有效的逆轉(zhuǎn)肝纖維化的藥物。國內(nèi)學者研究發(fā)現(xiàn)，許多傳統(tǒng)中草藥具有較好的抗肝纖維化療效，如丹參、冬蟲夏草、復方鱉甲軟肝片等具有軟堅散節(jié)、活血化瘀功效的單方、復方中藥制劑，特別是中藥組方多環(huán)節(jié)、多層次及多靶點的綜合作用[2]。本研究建立大鼠肝纖維化模型，觀察了不同劑量軟肝沖劑作用的效果，以期為臨床治療肝纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重180g±20g，由河北醫(yī)科大學動物實驗中心提供(合格證號:DK0410-0054)。軟肝沖劑，白求恩國際和平醫(yī)院制劑科配制;復方鱉甲軟肝片，內(nèi)蒙古集寧制藥廠(批號:20120612)。層粘連蛋白(LN)、透明質(zhì)酸(HA)檢測試劑盒，上海海軍醫(yī)學研究所。

1.2 實驗動物分組和給藥 隨機選取10只大鼠作為正常對照組(A組);其余40只大鼠制備肝纖維化模型:40%四氯化碳(橄欖油稀釋，2次/周)和40%酒精(1次/d)灌胃，20周后處死大鼠，以肉眼觀察到肝硬化結(jié)節(jié)形成及鏡下假小葉形成為模型誘導成功[3]。將成模大鼠隨機分為4組，每組10只:模型組(B組)，軟肝沖劑低劑量組(C組，4g/ kg/d)、軟肝沖劑高劑量組(D組，8g/kg/d)，鱉甲軟肝片組(E組，0.8g/kg/d)。C組、D組大鼠分別灌胃給予不同劑量的軟肝沖劑8周，E組大鼠灌胃給予復方鱉甲軟肝片8周，A組、B組大鼠灌胃給予等體積的生理鹽水。

1.3 取材和指標檢測

1.3.1 檢測血液指標:各組大鼠用藥結(jié)束后4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血后分離血清。①檢測肝功能指標:于承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科采用全自動生化分析儀檢測丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)和總膽紅素(TBil)的含量。②肝纖維化指標:應(yīng)用放射免疫法按照試劑盒說明進行操作檢測LN和HA的含量。

1.3.2 檢測肝組織羥脯氨酸(HYP)的含量:大鼠取血后斷頭處死，取肝組織冰浴下勻漿，采用胃酸酶解法測定不同濃度標準品和肝組織OD560值，制備標準曲線并計算每克肝組織HYP的含量[4]。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SAS 8.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計處理，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝功能檢測結(jié)果 與模型組比較，各用藥組大鼠肝功能指標不同程度得到改善(P＜0.01，P＜0.05);并且，軟肝沖劑高劑量組的改善效果優(yōu)于軟肝沖劑低劑量組和復方鱉甲軟肝片組。見表1。

表1 各組大鼠的肝功能(±s，n=10)

表1 各組大鼠的肝功能(±s，n=10)

與B組比較:aP＜0.01，bP＜0.05;與C組比較:cP＜0.01;與E組比較:dP＜0.05，eP＜0.01

組別 ALT(U/L) ALB(g/L) TBil(μmol/L) A組 24.3±7.4a 39.3±1.9a 17.2±2.9bB組 193.2±25.0 35.2±1.7 22.9±6.6 C組 130.5±21.7a 36.7±1.6 18.1±3.2bD組 99.7±21.4acd 40.3±2.3ace 15.4±3.3aE組 125.4±21.5a 36.3±1.7 18.6±3.6b

2.2 大鼠肝纖維化指標檢測結(jié)果 與模型組比較，各用藥組大鼠HA、LN的含量明顯降低(P＜0.01);并且，軟肝沖劑高劑量的效果優(yōu)于軟肝沖劑低劑量和復方鱉甲軟肝片。見表2。

表2 各組大鼠肝纖維化指標檢測結(jié)果和肝組織HYP的含量(±s，n=10)

表2 各組大鼠肝纖維化指標檢測結(jié)果和肝組織HYP的含量(±s，n=10)

與B組比較:aP＜0.01;與D組比較:bP＜0.01;與E組比較:cP＜0.01，dP＜0.05

組別 HA(ng/ml) LN(ng/ml) HYP(?g/g肝組織) A組 116.3±11.9a 106.9±8.8a 13.9±2.6aB組 1022.3±62.6 796.9±55.4 115.6±8.7 C組 726.3±36.9ab 310.3±21.9abc 56.9±6.8abdD組 485.6±49.5ac 228.9±29.6ac 35.1±3.1acE組 729.8±79.0a 513.0±24.9a 62.5±3.3a

2.3 大鼠肝組織HYP的含量 與模型組比較，各用藥組大鼠肝組織HYP的含量明顯降低(P＜0.01);并且，軟肝沖劑高劑量的效果優(yōu)于軟肝沖劑低劑量和復方鱉甲軟肝片。見表2。

3 討論

軟肝沖劑由丹參、黃芪、當歸、桃仁、黨參、梔子、黃芪、茵陳等10余味中藥組成，具有活血軟堅、化痰除濕的功效。其中，丹參在臨床以及實驗研究中均被證實有較明確的抗肝纖維化作用，機制可能與其阻斷肝臟Kupffer細胞和肝星形細胞活化、下調(diào)細胞因子表達、減少膠原蛋白合成及促進自由基清除等多方面的作用有關(guān)[5]。黃芪具有補中益氣、升陽固表等功效，實驗研究發(fā)現(xiàn)，黃芪可明顯減少總膠原及Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ型膠原在大鼠肝臟的病理性沉積，降低膠原蛋白含量，逆轉(zhuǎn)肝纖維化[6];體外實驗也發(fā)現(xiàn)，黃芪可明顯抑制體外激活的肝星形細胞的增殖和膠原的產(chǎn)生[7];臨床應(yīng)用黃芪注射液可以明顯改善肝纖維化[8]。另外，當歸可活血補血;桃仁散瘀結(jié)積聚，對實驗性肝損害和中毒性肝炎，有保護肝細胞和恢復肝功能的作用，并可防止肝糖原降低，對體外培養(yǎng)肝細胞DNA、RNA的合成有促進作用[9];菌陳可減輕肝細胞腫脹、變性和壞死的程度，對實驗性肝損傷有保護作用[10]。

中醫(yī)學認為肝纖維化屬于“瘤”、“痹”、“痞”、“積”等范疇，痰瘀互結(jié)致使全身氣、血、津液運行不暢，陰陽失調(diào)，嚴重時導致肝硬化。軟肝沖劑根據(jù)辨證論治理論，以及單味藥物抗肝纖維化的各種分子機制，應(yīng)用10余味藥物組方，應(yīng)用于大鼠肝纖維化模型，并與傳統(tǒng)抗肝纖維化藥物鱉甲軟肝片比較，從肝功能和纖維化指標等多方面證實，軟肝沖劑能改善大鼠肝功能，降低HA、LN以及肝組織HYP的含量，療效不僅優(yōu)于鱉甲軟肝片，且隨著治療劑量的增大，治療效果更明顯。因此提示，軟肝沖劑對大鼠肝纖維化模型治療效果明確，但其具體抗肝纖維化的機制還有待進一步深入研究。

[1]孫魯琨，王貴波.肝纖維化機制研究進展[J].西南國防醫(yī)藥，2009，19(12):1308-1310.

[2]賈水蓮，吳碧元.中藥成方制劑治療肝硬化的品種概況[J]浙江中醫(yī)藥大學學報，2008，32(4):561-563.

[3]張磊，李俊，朱鵬里，等.四氯化碳誘導大鼠肝纖維化進展期和恢復期模型的建立[J].中國藥理學通報，2011 27(12):1757-1760.

[4]Okuyama H, Nakamura H, Shimahara Y, et al. Overexpression of thioredoxin prevents thioacetamide- induced hepatic fi brosis inmice [J]. J Hepatol, 2005, 42(1):117-123.

[5]陶艷艷，劉成海.丹參及其化學成分抗肝纖維化作用機制研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合學報，2004，2(2):145-148.

[6]呂志平，劉曉燕，馬俊萍.黃芪抗肝纖維化的研究進展[J].陜西中醫(yī)，2003，24(7):652-654.

[7]張霄翔，楊雁，陳敏珠.黃芪多糖對HSC-T6細胞增殖及膠原產(chǎn)生的影響[J].中國臨床藥理學與治療學，2003， 8(6):645-647.

[8]陸江，李辰蕊.黃芪注射液對早期肝硬化患者生化及肝纖維化指標的影響[J].山東中醫(yī)雜志，2003，22(12):714-715.

[9]劉成，劉平，徐列明，等.桃仁提取物合蟲草菌絲治療肝炎后肝硬化的觀察[J].中醫(yī)雜志，1991，(7):20-23.

[10]仲雨，秦明珠.茵陳大孔樹脂提取物對CCl4所致肝損傷的影響[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(1):13-14.

(基礎(chǔ)醫(yī)學欄目編輯:陳志宏)

EXPERIMENTAL STUDY OF RUANGANCHONGJI ON LIVER FIBROSIS IN RATS

JIANG Fu-yi, ZHANG Guang-ling
(Hebei Union University, Hebei Tangshan 063000, China)

Objective: To explore the therapeutic effects of Ruanganchongji on rat liver fi brosis model.Methods:50 male Wistar rats were randomly divided into normal control group, model group, Ruanganchongji low dose group (4g/kg/d), Ruanganchongji high dose group (8g/kg/d) and Biejiaruanganpian group (0.8g/kg/d), with 10 rats in each group. The rat liver fi brosis model was established by lavaging 40% carbon tetrachloride and 40% alcohol; then the rats in each drug group were lavaged with corresponding drugs for 8-week. The liver function, liver fi brosis indexes (laminin and hyaluronic acid) and hydroxyproline content in liver were respectively detected.Results:Ruanganchongji could improve the liver function of liver fi brosis rat model; reduce the content of laminin, hyaluronic acid, and hydroxyproline content in liver obviously. Moreover, the effects of Ruanganchongji high dose were better than Ruanganchongji low dose and Biejiaruanganpian.Conclusions:Ruanganchongji has better therapeutic effects on liver fi brosis model rats, but the mechanisms need further study.

Ruanganchongji; Liver fi brosis; Liver function; Hydroxyproline

R575.2

A

1004-6879(2014)03-0200-03

2013-09-30)

△ 通訊作者