廖文筠

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，其可以分化成熟為內(nèi)皮細(xì)胞，參與血管形成及血管內(nèi)皮損傷后修復(fù)，EPCs內(nèi)活性氧類（Reactive oxygen species，Ros）生成失衡，將導(dǎo)致正常EPCs 生長(zhǎng)周期紊亂，過(guò)多的ROS 甚至誘導(dǎo)其凋亡。雖然近年來(lái)有關(guān)EPCs 體外培養(yǎng)及ROS通過(guò)細(xì)胞信號(hào)通路誘導(dǎo)EPCs凋亡的研究已經(jīng)取得很大進(jìn)展，但仍有很多問(wèn)題有待進(jìn)一步解決，本文主要對(duì)EPCs的生物學(xué)特性、EPCs相關(guān)的ROS增多機(jī)制、氧化應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)EPCs 功能影響等問(wèn)題進(jìn)行綜述。

1 EPCs的來(lái)源、分類及鑒定

內(nèi)皮祖細(xì)胞是Asahara等［1］在1997年首次從成人外周血中分離出的成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，因?yàn)槠淇梢苑只墒鞛閮?nèi)皮細(xì)胞，參與血管形成，所以在糖尿病血管病變中其增殖和修復(fù)能力對(duì)損傷血管的恢復(fù)有重要作用。EPCs 一般來(lái)源有外周血，骨髓和臍帶血，來(lái)源不同的EPCs s 在分化過(guò)程中，表面標(biāo)志物和形態(tài)會(huì)有差異，典型的EPCs特征會(huì)呈現(xiàn)梭形，細(xì)胞群會(huì)呈現(xiàn)出“鵝卵石”形態(tài)［2］。

EPCs最常見(jiàn)的分類方法是按照培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短分類：前者在體外培養(yǎng)4～7 天獲得，而晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞則需要更多的時(shí)間，一般為2～4 周。有學(xué)者研究表明，早期EPCs在體外培養(yǎng)兩周后逐漸凋亡消失，而晚期EPCs在體外培養(yǎng)2～4周出現(xiàn)，并快速增殖，可以進(jìn)行傳代［3］。

EPCs 鑒定是通過(guò)細(xì)胞表面標(biāo)志物，但還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種定義內(nèi)皮祖細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物。Peichev［4］等描述內(nèi)皮祖細(xì)胞為VEGFR-2+/CD133+/CD34+細(xì)胞，Reyes［5］等通過(guò)研究證實(shí)了CD34+CD133+VEGFR-2+細(xì)胞可以分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，并且可以發(fā)育為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。最近研究表明E-selection,pecam-1,VE-cadherin 也可作為表面標(biāo)志物去鑒定內(nèi)皮祖細(xì)胞，還可通過(guò)檢測(cè)其對(duì)FITC 標(biāo)記的UEA-1 的吸附和內(nèi)吞DiI-ac-LDL來(lái)進(jìn)行細(xì)胞功能學(xué)的鑒定。

2 活性氧類ROS增多的相關(guān)機(jī)制對(duì)EPCs的功能影響

活性氧類是體內(nèi)一類含氧的單電子還原產(chǎn)物，是電子在未能傳遞到末端氧化酶之前漏出呼吸鏈并消耗大約2%的氧產(chǎn)生，包括氧的一電子還原產(chǎn)物超氧陰離子（O2-）、二電子還原產(chǎn)物過(guò)氧化氫（H2O2）、三電子還原產(chǎn)物羥自由基（OH-）以及NO等。ROS的產(chǎn)生主要是線粒體狀態(tài)向狀態(tài)Ⅳ轉(zhuǎn)換中高氧環(huán)境和還原態(tài)的呼吸鏈?zhǔn)勾罅侩娮勇┏霾⑦€原氧分子而形成。ROS可以是細(xì)胞正常代謝的產(chǎn)物，也可由外源性因素刺激產(chǎn)生，極易與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂類、染色質(zhì)DNA發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，引起細(xì)胞損傷。細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在ROS生成和拮抗體系，當(dāng)兩者功能處于平衡狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞正常發(fā)育生長(zhǎng)，如出現(xiàn)體系之間強(qiáng)弱不等，將導(dǎo)致正常細(xì)胞生長(zhǎng)周期紊亂，甚至誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.1 血管緊張素Ⅱ與NA D PH 氧化酶途徑 LiH ong等［6］在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)不同NA D PH 氧化酶（NO X）同系物與晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞衰退的相關(guān)性研究中提出血管緊張素Ⅱ使不同NADPH 氧化酶（NOX）同系物（如NOX2和NOX4）的上調(diào)而產(chǎn)生過(guò)量ROS，使晚期EPCs發(fā)生功能衰退。替米沙坦能有效地抑制這種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，具有延緩EPCs 衰老的作用。血管緊張素Ⅱ通過(guò)上調(diào)NOX2 和NOX4 加速EPCs 凋亡，如果再能對(duì)NADPH氧化酶（NOX）進(jìn)行特異性抑制，將會(huì)大大減少EPCs 凋亡，這為血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)和治療提供新的思路。

2.2 Hka（高分子量激肽原裂解片段）途徑 Hka（高分子量激肽原裂解片段）是等離子激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)的一個(gè)活性產(chǎn)物，其介導(dǎo)產(chǎn)生的ROS 加速了EPCs 衰老進(jìn)程，抑制了內(nèi)皮細(xì)胞功能。研究發(fā)現(xiàn)HKa通過(guò)激活ROS-p38激酶-p16（INK4a）信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)加速EPCs 衰老進(jìn)程，Dai J 等［7］經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)得出Hka可能具有誘導(dǎo)EPCs衰退的潛能。

2.3 亞甲基四氫葉酸還原酶（Mthfr）途徑 EPCs 的生物學(xué)功能及其生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)新生血管形成和內(nèi)皮再生有重要作用，其促進(jìn)血管修復(fù)功能取決于ROS 水平高低，亞甲基四氫葉酸還原酶（Mthfr）缺陷型細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）解偶聯(lián)，ROS 升高以及SIRT1 表達(dá)下調(diào)而影響EPCs 的壽命，使其功能衰退［8］。也有相關(guān)研究報(bào)道，敲出Mthfr 基因的雜合體小鼠，其體內(nèi)同型半胱氨酸水平升高了1.5-2倍?；几咄桶腚装彼嵫Y的小鼠外周循環(huán)EPCs數(shù)量明顯減少。以此同時(shí)，血循環(huán)中ROS升高而eNOS的含量降低，使SIRT1表達(dá)也下調(diào)，嚴(yán)重影響EPCs的分化能力。由此可見(jiàn)，亞甲基四氫葉酸還原酶與ROS的關(guān)系可通過(guò)SIRT1（Ⅲ類組蛋白去乙酰酶）來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。有研究發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀等藥物可抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)所致的內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能障礙和凋亡，這為臨床降脂藥物治療高同型半胱氨酸所致EPCs損傷提供了理論依據(jù)［9］。

2.4 炎癥因子C反應(yīng)蛋白 糖基化終末產(chǎn)物表達(dá)受體在機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)程和內(nèi)皮功能活動(dòng)中扮演一個(gè)非常重要的角色，但如何調(diào)控糖基化終末產(chǎn)物表達(dá)并不清楚，C 反應(yīng)蛋白（CRP）可能是一個(gè)關(guān)鍵因素，Chen J 等［10］研究報(bào)道CRP 可能通過(guò)上調(diào)了糖基化終末產(chǎn)物表達(dá)的受體，改變了抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)，增強(qiáng)了EPCs對(duì)氧化應(yīng)激所致的凋亡的敏感性以及促進(jìn)動(dòng)脈硬化的發(fā)生與進(jìn)展。如能研發(fā)對(duì)抗炎癥因子C反應(yīng)蛋白的特異性藥物，降低EPCs 對(duì)氧化應(yīng)激所致凋亡的敏感性，使其在循環(huán)中的數(shù)量提升，可有助于損傷血管的修復(fù)。

3 氧化應(yīng)激信號(hào)通路對(duì)EPCs功能影響

3.1 P66shcA 通路 存在于哺乳動(dòng)物中的三種Shc基因，被分別命名為ShcA、ShcB 和ShcC，其中ShcA的機(jī)制研究最為清楚。人的ShcA基因定位于第1條染色體（1q21），廣泛表達(dá)于多個(gè)組織。其選擇性拼接可產(chǎn)生兩種mRNA，分別為p46Shc/p52Shc 和p66Shc，前者是同一種mRNA 由于翻譯起始位點(diǎn)不同而產(chǎn)生的兩種蛋白質(zhì)。因p66Shc比另外兩種蛋白質(zhì)在N末端多出一個(gè)富含脯氨酸結(jié)構(gòu)（CH2），因此獲得了特殊的功能，在調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡、衰老過(guò)程中具有重要作用［11］。P66shcA 是調(diào)節(jié)凋亡應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激的一個(gè)基因，p66shcA敲出的小鼠在各種病理生理的干預(yù)下表現(xiàn)出ROS產(chǎn)物的降低和ROS誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的抵抗力的增加。國(guó)內(nèi)外研究證明了高糖環(huán)境可通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)ROS 含量誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，Di Stefano V 等［12］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮祖細(xì)胞在高糖的培養(yǎng)下上調(diào)了p66shcA蛋白的表達(dá)，暴露在高糖環(huán)境下的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量顯著降低。p66shcA 基因敲出的EPCs 對(duì)高糖所致的氧化應(yīng)激損傷表現(xiàn)不敏感。

p66shc可以上調(diào)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的敏感性，研究者可以通過(guò)抑制p66shc 氧化應(yīng)激通路而達(dá)到抗氧化的目的，然而在血管系統(tǒng)p66shc表達(dá)的負(fù)調(diào)控機(jī)制方面的研究十分有限。Shuang Zhou等［13］研究探索了SIRT1 的重要功能，它是一種Ⅲ類組蛋白去乙酰酶，其對(duì)p66shc的表達(dá)和高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致內(nèi)皮功能障礙具有調(diào)節(jié)作用。在不同種類的Ⅲ類組蛋白去乙酰酶抑制劑的作用下人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞和239A細(xì)胞的p66shc基因轉(zhuǎn)錄物和蛋白的表達(dá)明顯增加。腺病毒轉(zhuǎn)染SIRT1的人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1過(guò)度表達(dá)抑制高糖所致的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的p66shc 上調(diào)。與鏈脲霉素誘導(dǎo)的野生型糖尿病小鼠相比，內(nèi)皮特異性SIRT1轉(zhuǎn)基因糖尿病小鼠減少p66shc表達(dá)（包括mRNA 和蛋白方面），改善血管內(nèi)皮功能，減少累積的硝基酪氨酸和8-OHdG（氧化應(yīng)激的標(biāo)記）。相關(guān)學(xué)者發(fā)現(xiàn)SIRT1 能夠結(jié)合p66shc 啟動(dòng)子區(qū)（-508bp—-250bp），導(dǎo)致組蛋白H3 結(jié)合到p66shc 啟動(dòng)子區(qū)域的乙?；饔脺p弱，進(jìn)而減少p66shc相關(guān)產(chǎn)物表達(dá)。P66shcA 通路的研究可以為氧化應(yīng)激所致血管損傷的治療提供理論基礎(chǔ)，但目前對(duì)其具體的作用機(jī)理研究得還不夠深入。

3.2 腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）通路 最近研究發(fā)現(xiàn)MnSOD 表達(dá)的降低可導(dǎo)致糖尿病EPCs 功能障礙。Xiao-Rong Wang 等［14］驗(yàn)證了AMPK 通路通過(guò)MnSOD 抑制高糖所誘導(dǎo)的線粒體ROS 生成改善EPCs的功能。在鏈脲霉素誘導(dǎo)的1型糖尿病小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞中MnSOD蛋白表達(dá)下降。糖尿病的EPCs減少了MnSOD 的生成，增加了線粒體過(guò)氧化物產(chǎn)生。在人體內(nèi)可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞的MnSOD 含量來(lái)判斷ROS含量的水平，它們之間呈反比關(guān)系。

Xiao-Rong Wang 等通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)：Ad-AMPK-DN 的轉(zhuǎn)入抑制AMPK 的表達(dá)活性，MnSOD的產(chǎn)生減少，ROS 生成增加，使EPCs 不能很好的成管。糖尿病組加入AICAR（AMPK 激動(dòng)劑）的EPCs成管較好。轉(zhuǎn)入Ad-AMPK-DN的EPCs粘附，遷移能力下降，在糖尿病組加入AICAR 的EPCs 粘附、遷移能力得以恢復(fù)。PP2A是蛋白磷酸酶2A，糖尿病的影響下可使EPCs 的PP2A 生成增加，使AMPK 表達(dá)活性降低。在糖尿病組中轉(zhuǎn)入PP2A siRNA，使AMPK的表達(dá)恢復(fù)，從而增加MnSOD 的生成。為了驗(yàn)證PP2A的作用效果，從而提高實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性，因此加入PP2A抑制劑OA（岡田酸），從而使受氧化應(yīng)激損傷的EPCs 的AMPK 表達(dá)升高，增加了MnSOD 的水平，減少ROS 的生成。通過(guò)上述科學(xué)的實(shí)驗(yàn)得出，AMPK通過(guò)MnSOD 途徑改善氧化應(yīng)激損傷的EPCs 的血管生成功能。

3.3 PI3k/AKT 通路 有相關(guān)研究報(bào)道，匹格列酮具有阻斷H2O2引發(fā)EPCs 凋亡的功能,其是一種過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor,PPAR-γ）的激動(dòng)劑，渥曼青霉素是PI3k/AKT 通路的阻斷劑，當(dāng)PI3k/AKT 通路被阻斷后，匹格列酮不能有效發(fā)揮其抗凋亡的作用，這說(shuō)明此通路與EPCs 內(nèi)ROS 生成有明顯的相關(guān)性［15］。他汀類藥物和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）可以阻止由H2O2誘導(dǎo)的EPCs的凋亡,且通過(guò)對(duì)PI3K/AKT 途徑的抑制這種抗凋亡作用可以被逆轉(zhuǎn)［16］。PI3k/AKT 途徑可能對(duì)EPCs 氧化應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控起著十分重要的作用，但目前在此方面的研究還十分有限。

4 小 結(jié)

內(nèi)皮祖細(xì)胞在血管損傷的修復(fù)方面有著重大的作用，如果能減少氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)EPCs的負(fù)面影響，將顯著降低心血管疾病的發(fā)生率和死亡率，因此，研究氧化應(yīng)激產(chǎn)物對(duì)EPCs 的影響具有重大的臨床價(jià)值。但是，在國(guó)內(nèi)外科研進(jìn)展中，EPCs氧化應(yīng)激相關(guān)的P66shcA 和PI3k/AKT 通路的研究還不夠深入，其作用的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

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