邵俊國(guó)，魏媛媛，張金艷△，馮 鑫，張洪濤，劉志廣，李筱芳

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院檢驗(yàn)科，石家莊1050011；2.北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所中心實(shí)驗(yàn)室 101149；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所真菌科，北京100730）

近年來(lái)，隨著治療藥物和方法不斷增多，諸如激素、免疫抑制劑、抗菌藥物以及放療、化療等，使得真菌的分布和種類(lèi)發(fā)生變化，醫(yī)院真菌感染發(fā)病率不斷增加，嚴(yán)重感染時(shí)可造成血液和內(nèi)臟器官感染，給患者的預(yù)后和生命安全帶來(lái)很大的威脅。氟康唑因其不良作用小，生物利用度高，是真菌感染特別是白念珠菌感染的預(yù)防和治療的首選藥物。但是由于氟康唑長(zhǎng)期大劑量使用，其耐藥性已經(jīng)十分普遍，嚴(yán)重影響藥物治療效果。本文通過(guò)研究白念珠菌體外藥敏試驗(yàn)和對(duì)白念珠菌CDR1、CDR2、MDR1耐藥基因在耐藥株和敏感株表達(dá)水平的差異分析，探討耐藥基因表達(dá)與氟康唑耐藥的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院2010年5月至2012年6月各臨床科室送檢的尿液、痰液、血液、咽拭子和糞便標(biāo)本，經(jīng)念珠菌顯色培養(yǎng)基鑒定為白念珠菌。選取115株白念珠菌采用微量稀釋法對(duì)氟康唑的敏感性進(jìn)行測(cè)定；選取藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)的敏感株組和耐藥株組各35株，采用PCR技術(shù)對(duì)比兩組CDR1、CDR2、MDR1基因的表達(dá)情況。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均為本院檢驗(yàn)科送檢的樣本；（2）經(jīng)鑒定為白念珠菌；（3）所有操作均符合本院檢驗(yàn)科操作標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 白念珠菌對(duì)氟康唑最小抑菌濃度（MIC）值測(cè)定采用微量稀釋法［1］（1）將白念珠菌置于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA培養(yǎng)基）中活化后在4℃條件下保存，備用。（2）取少量白念珠菌接種于YEPD培養(yǎng)液中，400r／min振蕩培養(yǎng)，溫度28～30℃，活化24h，維持真菌在指數(shù)生長(zhǎng)期后期。（3）在顯微鏡下使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度在2×103～5×103cfu／mL。（4）取96孔板，在每排的1號(hào)孔中加入100μL RPMI-1640培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，2～11號(hào)孔加入濃度分別為128.00、64.00、16.00、8.00、4.00、2.00、1.00、0.50、0.25μg／mL的氟康唑注射液，12號(hào)孔作為陽(yáng)性對(duì)照。（5）將藥敏板培養(yǎng)24h后，采用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的OD值，并與陽(yáng)性對(duì)照對(duì)比，其中OD值下降80%以上的濃度為MIC值。實(shí)驗(yàn)平行操作2～3次，當(dāng)兩次MIC值差一個(gè)濃度時(shí)，選取較高濃度作為MIC值。

1.2.2 耐藥基因的表達(dá)測(cè)定［2］（1）總 RNA 的提取分離將1.2.1試驗(yàn)中處于指數(shù)生長(zhǎng)后期的菌液離心，棄去上清液，無(wú)菌蒸餾水沖洗后用酵母菌總RNA抽提試劑盒提取白念珠菌總RNA，再加入1UDNaseⅠ溫浴2h。（2）cDNA合成取1 μL RNA于PCR管中，加入1μL RNase抑制劑、5μL緩沖液、3μL dNTP、30mmol／L MgCl23μL、ddH2O 5.5μL、隨機(jī)引物0.5μL、逆轉(zhuǎn)錄酶1μL組成RT反應(yīng)體系，總體系20μL，置于PCR儀中，設(shè)定參數(shù)：30℃5min，40℃10min，98℃3min，5℃4min，結(jié)束反應(yīng)后將產(chǎn)物于-20℃條件下保存?zhèn)溆?。?）引物設(shè)計(jì)18SrRNA作為內(nèi)參照的引物，上游為5′-TCT TGT ACG GCA CAT ATC TCG T-3′，下游為5′-GTT TCG AGA GGA CCT TCA GTC-3′，長(zhǎng)度為150bp；CDR1上游引物為5′-CAA TCA TAT TTC GTC CGA TC-3′；下游為5′-CAT CGG CTC ATT TCC AGT AC-3′，長(zhǎng)度為116bp；CDR2上游引物為5′-TGA CCA GAT CTT ATT AGC A-3′，下游引物為 5′-CCG TCC ATG TAG TCC CGT C-3′，長(zhǎng)度為160bp；MDR1上游引物為5′-CTC TCA TCG GGT TTC GCA TG-3′；下游為5′-AAT TGT GTG TTA GCT ACT AG-3′，長(zhǎng)度為112bp。（4）PCR總反應(yīng)體積20μL，含ddH2O 8μL，cDNA 2μL，Taq酶8μL，上下游引物均為1μL。PCR中擴(kuò)增和定量，參數(shù)設(shè)置為95℃變性30s，90℃退火1min，70℃20s，42次循環(huán)。

1.3 判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)［3］，敏感（S）：MIC≤8μg／mL，耐藥（R）：MIC≥64μg／mL。采用LightCycler系統(tǒng)軟件計(jì)算CT值，△CT值＝目的基因CT值-18SrRNA CT值；其中△CT值越小，相對(duì)基因表達(dá)量越高，反之則越低。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行檢驗(yàn)，計(jì)量資料均用±s表示，采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白念珠菌對(duì)氟康唑MIC測(cè)定結(jié)果 115株白念珠菌對(duì)氟康唑的半數(shù)抑菌范圍為5μg／mL，90%抑菌范圍為126μg／mL；其中76株敏感，39株耐藥，敏感率為66.1%，耐藥率為36.8%；對(duì)耐藥菌株來(lái)源進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，痰液的白念珠菌耐藥率為37.7%，尿液22.2%，糞便29.4%，咽拭子36.8%，見(jiàn)表1。

表1 115株白念珠菌對(duì)氟康唑敏感性測(cè)定結(jié)果

2.2 耐藥株組和敏感株組耐藥基因△CT值對(duì)比 敏感株組CDR1基因△CT值與耐藥株比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.725，P＞0.05）；敏感株組CDR2基因△CT值明顯高于耐藥株組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝2.659，P＜0.05）；敏感株組MDR1基因△CT值與耐藥株組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝0.805，P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 耐藥株組和敏感株組耐藥基因△CT值對(duì)比（±s，n＝35）

表2 耐藥株組和敏感株組耐藥基因△CT值對(duì)比（±s，n＝35）

△CT值組別7.81±2.13 9.33±3.21 9.67±2.93耐藥株組 7.38±2.79 7.49±2.54 9.14±2.57 t 0.725 2.659 0.805 P＞0.05 ＜0.05 ＞0.05 CDR1 CDR2 MDR1敏感株組

3 討 論

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，約有200種真菌可以引起人體疾病。隨著免疫抑制劑、激素和大量抗生素在臨床的廣泛使用，加之各種介入治療不斷增多，導(dǎo)致真菌感染的發(fā)病率逐年增加，其中白念珠菌感染最為多見(jiàn)［4］。白念珠菌感染后往往侵犯內(nèi)臟器官、血液系統(tǒng)，給患者的治療和預(yù)后帶來(lái)極大的威脅。目前臨床上治療白念珠菌主要是三唑類(lèi)抗真菌藥，其主要通過(guò)對(duì)真菌細(xì)胞羊毛甾醇的去甲基反應(yīng)，使真菌細(xì)胞質(zhì)膜完整性缺失，進(jìn)而抑制真菌的繁殖和生長(zhǎng)。氟康唑因生物利用度高、安全性好而成為臨床上使用最廣泛的三唑類(lèi)抗真菌藥，并且對(duì)真菌感染取得了滿(mǎn)意療效［5-6］。氟康唑與其他三唑類(lèi)藥物一樣，對(duì)真菌的生長(zhǎng)和繁殖起到抑制作用，但是對(duì)真菌無(wú)殺滅作用，因此在反復(fù)和長(zhǎng)期給藥過(guò)程中容易導(dǎo)致對(duì)氟康唑耐藥菌株的出現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn)［7］，65%～75%的真菌感染屬于白念珠菌感染，其中85%以上的白念珠菌對(duì)氟康唑出現(xiàn)耐藥性，甚至部分已經(jīng)對(duì)兩性霉素B產(chǎn)生耐藥。因此需要對(duì)白念珠菌的耐藥原因進(jìn)行研究，為臨床治療提供指導(dǎo)。

白念珠菌的耐藥機(jī)制主要有以下幾個(gè)方面與耐藥基因表達(dá)增加有關(guān)［8-15］，目前已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)的耐藥基因有CDR1、CDR2和MDR1，這3種基因高表達(dá)可以誘發(fā)白念珠菌產(chǎn)生耐藥。目前對(duì)白念珠菌耐藥機(jī)制的研究主要是通過(guò)同一表型嚴(yán)格配對(duì)基礎(chǔ)上，然而尚元元等［10］研究發(fā)現(xiàn)，白念珠菌敏感株和耐藥株的耐藥機(jī)制無(wú)法解釋非配對(duì)耐藥株的耐藥機(jī)制，因此需要對(duì)非配對(duì)耐藥株和敏感株表達(dá)情況進(jìn)行研究，分析其可能的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，115株白念珠菌中有76株敏感，39株耐藥，敏感率為66.1%，耐藥率為36.8%；這說(shuō)明白念珠菌對(duì)氟康唑的耐藥情況已經(jīng)相當(dāng)嚴(yán)重，這與氟康唑的臨床上大量使用有關(guān)，這就提示在臨床治療中，需要結(jié)合實(shí)驗(yàn)室藥敏檢查，選用其他抗真菌藥或者根據(jù)患者的具體情況進(jìn)行綜合治療，降低因不合理用藥引起的藥物耐藥發(fā)生率。對(duì)耐藥株組和敏感株組耐藥基因進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，CDR1基因和MDR1基因的表達(dá)水平在敏感株和耐藥株中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CDR2基因在耐藥株中的表達(dá)明顯高于敏感株（P＜0.05）。這一結(jié)果提示，耐藥基因表達(dá)增加可以引起白念珠菌耐藥，但是并非所有白念珠菌耐藥株均會(huì)同時(shí)出現(xiàn)上述3種基因表達(dá)增加。這也說(shuō)明白念珠菌的耐藥不是由幾個(gè)基因作用導(dǎo)致的，而是在多種因素不同水平下調(diào)節(jié)和控制作用實(shí)現(xiàn)的。

綜上，導(dǎo)致白念珠菌耐藥的原因較復(fù)雜，目前發(fā)現(xiàn)CDR2基因在耐藥株中的表達(dá)明顯高于敏感株，而CDR1基因和MDR1基因的表達(dá)水平在敏感株和耐藥株中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此需要進(jìn)一步研究更多的耐藥機(jī)制，為臨床治療提供科學(xué)的依據(jù)。

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