毛驍俊 綜述;唐子圣 審校

(上海200011:1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院牙體牙髓科，上海市口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室)

牙齦素是牙齦卟啉單胞菌最重要的毒力因子之一，在介導(dǎo)細菌與宿主相互作用中起著重要的作用［1-2］。隨著對牙齦素結(jié)構(gòu)及其基因多態(tài)性研究的逐步深入，人們發(fā)現(xiàn)牙齦素對于牙齦卟啉單胞菌的毒力有重要影響，從而推動了牙齦素相關(guān)抑制劑的研究進展。本文結(jié)合近年來的相關(guān)研究進展，就牙齦素的分子結(jié)構(gòu)、基因多態(tài)性、毒力作用及其抑制劑作一綜述。

1 牙齦素的分類和結(jié)構(gòu)

牙齦素(gingipains)是存在于牙齦卟啉單胞菌外膜、膜泡以及胞外的一組蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶;并因其具有梭菌蛋白酶的一些特征而被歸屬于梭菌蛋白酶家族。牙齦素可分為兩個大類:一類為精氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(牙齦蛋白酶R，gingipain R，Rgp)，另一類為賴氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(牙齦蛋白酶K，gingipain K，Kgp);其中Rgp又可分類為RgpA和RgpB。RgpA、RgpB和Kgp的相對分子質(zhì)量分別為 9.5×104、5×104和1.05×105，并分別由 rgpA、rgpB 和 kgp 3個基因編碼。此前認為RgpA和Kgpa的結(jié)構(gòu)均包括催化結(jié)構(gòu)域和黏附結(jié)構(gòu)域，而RgpB僅有催化結(jié)構(gòu)域;但近來研究發(fā)現(xiàn)，RgpB除含有催化結(jié)構(gòu)域外，還含有1個免疫球蛋白超家族域(immunoglobulin superfamily domain)和1個205個堿基的N-末端結(jié)構(gòu)域［3］。目前已證實，位于rgpA和kgp C-末端區(qū)域的血凝集素基因hagA可以編碼血凝集素等產(chǎn)物，而這些產(chǎn)物對牙齦卟啉單胞菌降解血紅蛋白、攝取血紅素均有重要的作用［4］。

2 牙齦素的基因多態(tài)性

2.1 kgp基因多態(tài)性

kgp基因多態(tài)性的研究主要根據(jù)其C-末端區(qū)域或催化域的多態(tài)性進行分類。Nadkarni等［5］在對34名牙周炎患者的齦下菌斑進行研究時發(fā)現(xiàn)，kgp的C-末端結(jié)構(gòu)域存在基因多態(tài)性，并可分為4種類型，分別為:Hg66型、381型、W83型，W83v型，各型比率為 8∶11∶6∶5;其中W83型與 W83v型基因有65%相似性、兩者均通過合成一種多肽而抑制血凝反應(yīng)。作者認為，kgp對毒力的影響主要表現(xiàn)為各基因型產(chǎn)生的血凝素活力不同。Beikler等［6］在對102名牙周炎患者的齦下菌斑進行研究時發(fā)現(xiàn)，kgp的催化結(jié)構(gòu)域中也有基因多態(tài)性，將聚合酶鏈式反應(yīng)得到的長度為890 bp的催化域片段進行MseI酶切后，可根據(jù)酶切片段長度不同將kgp催化域分為Ⅰ型(3個片段，長度分別為447、288、135 bp)和Ⅱ型(1 個片段，長度為890 bp);但是并未發(fā)現(xiàn)該分型與臨床癥狀有明顯的相關(guān)性。Li等［7］將上述催化域片段用EcoRⅠ酶切后，又將kgp催化域分為4型，但仍然未發(fā)現(xiàn)任何一種類型與臨床癥狀顯著相關(guān)。

2.2 rgpB基因多態(tài)性

rgpB的催化域可因堿基替換產(chǎn)生遺傳多態(tài)性，因此rgpB基因多態(tài)性研究主要根據(jù)其催化域的多態(tài)性進行分類。Beikler等［8］通過PCR方法得到2210 bp長度的rgpB的催化域片段，經(jīng)基因測序后將rgpB基因分為5種類型，分別為“NYPN”NSSN、NSSK、NYPK、DYPN 型。李琛等［9］通過酶切分析法將rgpB分為4型(?、ò、ó、?型)，并證明了不同基因型的rgpB對牙齦卟啉單胞菌的毒力均有影響。

2.3 rgpA基因多態(tài)性

rgpA在牙齦卟啉單胞菌的野生株中具有較高的保守性，只在催化域上有細微差異。Allaker等［10］在研究中發(fā)現(xiàn)，rgpA可分為3種類型，分別為:A、B、C型;經(jīng)分析后發(fā)現(xiàn)不同類型rgpA的致病性雖有所不同，但差異并不明顯。

3 牙齦素對牙齦卟啉單胞菌毒力的影響

多年來的研究已證明牙齦素是牙齦卟啉單胞菌重要的毒力因子之一，其不僅在介導(dǎo)細菌與宿主的相互作用中起著重要的作用，同時還影響牙齦卟啉單胞菌的毒力［11］。在各類牙齦素中，rgpB是一種加工酶，參與牙齦卟啉單胞菌外膜致病因子的處理，從而有助于牙齦卟啉單胞菌在口腔內(nèi)的定植［12］。Guentsch 等［13］報道，牙周炎患者牙周袋中的rgpB濃度可超過1 μmol/L，并認為rgpB與牙周病的發(fā)病有一定相關(guān)性。

kgp可通過與血紅蛋白結(jié)合而使血紅蛋白降解，并同時凝集血紅素，從而參與牙齦卟啉單胞菌的定植;影響牙齦卟啉單胞菌的生長及其毒力。Haraguchi等［14］發(fā)現(xiàn)，kgp對于伴放線聚集桿菌生物膜的脫落和減少有非常重要的作用，并可通過增強牙齦卟啉單胞菌與伴放線聚集桿菌的競爭優(yōu)勢而對牙齒表面菌斑的成熟起到一定作用。雖然kgp參與生產(chǎn)的是一種結(jié)構(gòu)尚未明確的酶，但從以上結(jié)果可見，該酶可以對伴放線聚集桿菌的聚集產(chǎn)生破壞，并與牙齦卟啉單胞菌的競爭優(yōu)勢相關(guān)。

rgpA和kgp均參與牙齦卟啉單胞菌對口腔上皮細胞的黏附過程，并同時與其他細菌有聚合作用［15］。Guo等［16］在動物模型研究中發(fā)現(xiàn)，kgp 和rgpA對種植體周圍炎的發(fā)生均起到了非常重要的作用。Pathirana等［17］在對牙周炎模型小鼠的頜骨缺失情況、頜骨細菌量情況、血清抗體反應(yīng)以及各實驗菌株外膜的免疫敏感性進行測定后發(fā)現(xiàn)，各類型牙齦素對牙齦卟啉單胞菌毒力的影響程度為:kgp＞rgpB＞ ＞rgpA。

4 牙齦素抑制劑的研究進展

有研究發(fā)現(xiàn)，KYT-1和KYT-36分別為Rgp和kgp的專性抑制劑，兩者的結(jié)構(gòu)分別為:(Cbz)-Lys-Arg-CO-Lys-N(NH3)2和Cbz-Glu［NHN(CH3)Ph］Lys-CO-NHCH2Ph。Kataoka等［18］在KYT-1和KYT-36的基礎(chǔ)上，通過藥物結(jié)構(gòu)設(shè)計得到了 KYT-41，經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn) KYT-41對Rgp和kgp均有良好的抑制力和選擇性，均可通過破壞牙齦卟啉單胞菌的生理功能而產(chǎn)生強大的抑菌作用;在動物實驗中也驗證了KYT-41的治療牙周疾病的能力;尤其對狗的牙周探診深度更表現(xiàn)出了較好的治療效果和安全性。作者認為，這種雙重抑制劑不僅在治療牙周病過程中表現(xiàn)出顯著的抗炎活性，同時還可起到預(yù)防牙周病和治療早期牙周病的作用。Taiyoji等［19］研究發(fā)現(xiàn)，一種來自大米的十二肽CL(14-25)也是一種混合抑制劑，不僅對牙齦卟啉單胞菌有抗菌作用，同時還對Rgp有抑制作用，其抑制參數(shù)Ki和Ki＇分別為1.4×10-6mol/L和 4.3×10-6mol/L。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CL(14-25)的第15位精氨酸殘基對Rgp有強力的抑制作用，而第14位的精氨酸殘基則在CL(14-25)對Rgp的抑制過程中發(fā)揮介導(dǎo)作用，他們最終合成了一種新的專性Rgp抑制劑CL(K25A)，并對Rgp有良好的抑制作用;其抑制參數(shù)Ki和Ki＇分別為9.6 ×10-6mol/L 和1.9 ×10-6mol/L［20-22］。另有研究還發(fā)現(xiàn)牛乳鐵蛋白也可抑制kgp和Rgp，其雖然對浮游態(tài)牙齦卟啉單胞菌的生長僅有微弱的抑制作用，但卻能明顯抑制牙齦卟啉單胞菌的生物膜形成［23-24］。

5 小結(jié)

牙齦卟啉單胞菌是口腔常見疾病的主要致病菌之一，牙齦素是其主要的毒力因子。隨著牙齦素結(jié)構(gòu)和基因研究的進展，牙齦素對牙齦卟啉單胞菌毒力的影響將更為明確。相信隨著牙齦素抑制劑的發(fā)展，對牙齦卟啉單胞菌毒力的調(diào)控亦將愈加有效。

［1］Fitzpatrick RE，Wijeyewickrema LC，Pike RN.The gingipains:scissors and glue of the periodontal pathogen，Porphyromonas gingivalis［J］.Future Microbiol，2009，4(4):471-487.

［2］Yongqing T，Potempa J，Pike RN，et al.The Lysine-Specific Gingipain of Porphyromonas gingivalis［M］.Adv Exp Med Biol，2011:15-29.

［3］de Diego I，Veillard FT，Guevara T，et al.Porphyromonas gingivalis virulence factor gingipain rgpB shows a unique zymogenic mechanism for cysteine peptidases［J］.J Biol Chem，2013，288(20):14287-14296.

［4］Nakayama K.Novel functions of adhesins encoded by gingipain genes of Porphyromonas gingivalis［M］.Interface Oral Health Sci，2007:53-61.

［5］Nadkarni MA，Nguyen KA，Chapple CC，et al.Distribution of Porphyromonas gingivalis biotypes defined by alleles of the kgp(Lys-gingipain)gene［J］.J Clin Microbiol，2004，42(8):3873-3876.

［6］Beikler T，Peters U，Ehmke B，et al.Sequence analysis of kgp in Porphyromonas gingivalis isolates from periodontitis patients［J］.Oral Microbiol Immunol，2003，18(6):393-397.

［7］Li C，Liu J，Pan Y.The study of kgp genetic difference of Porphyromonas gingivalis in subgingival plaque［J］.J Oral Sci Res，2010，26(1):010.

［8］Beikler T，Peters U，Prior K，et al.Sequence variations in rgpA and rgpB of Porphyromonas gingivalis in periodontitis［J］.J Periodontal Res，2005，40(3):193-198.

［9］李琛，潘亞萍，林莉.齦下菌斑中牙齦卟啉單胞菌 rgpB基因多態(tài)性研究［J］.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，41(11):674-677.

［10］Allaker RP，Aduse-Opoku J，Batten JE，et al.Natural variation within the principal arginine-specific protease gene，prpR1，of Porphyromonas gingivalis［J］. Oral Microbiol Immunol，1997，12(5):298-302.

［11］Chen T，Duncan MJ:Gingipain adhesin domains mediate Porphyromonas gingivalis adherence to epithelial cells［J］.Microb Pathog，2004，36(4):205-209.

［12］Potempa J，Sroka A，Imamura T，et al.Gingipains，the major cysteine proteinases and virulence factors of Porphyromonas gingivalis:structure，function and assembly of multidomain protein complexes［J］.Curr Protein Pept Sci，2003，4(6):397-407.

［13］Guentsch A，Kramesberger M，Sroka A，et al.Comparison of gingival crevicular fluid sampling methods in patients with severe chronic periodontitis［J］.J Periodontol，2011，82(7):1051-1060.

［14］Haraguchi A，Miura M，F(xiàn)ujise O，et al.Porphyromonas gingivalis gingipain is involved in the detachment and aggregation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans biofilm［J］.Mol Oral Microbiol，2014，29(3):131-143.

［15］Kamaguchi A，Nakayama K，Ohyama T，et al.Coaggregation of Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia［J］.Microbiol Immunol，2001，45(9):649-656.

［16］Guo M，Wang Z，F(xiàn)an X，et al.kgp，rgpA and rgpB DNA Vaccines Induce Antibody Responses in Experimental Peri-Implantitis［Z］.J Periodontol，2014.

［17］Pathirana RD，O＇Brien-Simpson NM，Brammar GC，et al.and rgpB，but not rgpA，are important for Porphyromonas gingivalis virulence in the murine periodontitis model［J］.Infect Immun，2007，75(3):1436-1442.

［18］Kataoka S，Baba A，Suda Y，et al.A novel，potent dual inhibitor of Arg-gingipains and Lys-gingipain as a promising agent for periodontal disease therapy［J］.Faseb J，2014，28(1):1-15.

［19］Taiyoji M，Shitomi Y，Taniguchi M，et al.Identification of proteinaceous inhibitors of a cysteine proteinase(an Arg-specific gingipain)from Porphyromonas gingivalis in rice grain，using targeted-proteomics approaches［J］.J Proteome Res，2009，8(11):5165-5174.

［20］Taniguchi M，Matsuhashi Y，Abe TK，et al.Contribution of cationic amino acids toward the inhibition of Arg-specific cysteine proteinase(Arg-gingipain)by the antimicrobial dodecapeptide，CL(14-25)，from rice protein［Z］.Pept Sci，2014.

［21］Takei N，Takahashi N，Takayanagi T，et al.Antimicrobial activity and mechanism of action of a novel cationic α-helical dodecapeptide，a partial sequence of cyanate lyase from rice［J］.Pept Sci，2013，42:55-62.

［22］Taniguchi M，Takahashi N，Takayanagi T，et al.Effect of substituting arginine and lysine with alanine on antimicrobial activity and the mechanism of action of a cationic dodecapeptide CL(14-25)，a partial sequence of cyanate lyase from rice［J］.Pept Sci，2014，102(1):58-68.

［23］Dashper SG，Pan Y，Veith PD，et al.Lactoferrin inhibits Porphyromonas gingivalis proteinases and has sustained biofilm inhibitory activity［J］.Antimicrob Agents Chemother，2012，56(3):1548-1556.

［24］Wakabayashi H，Yamauchi K，Kobayashi T，et al.Inhibitory effects of lactoferrin on growth and biofilm formation of Porphyromonas gingivalis and Prevotella intermedia［J］.Antimicrob A-gents Chemother，2009，53(8):3308-3316.