孔維元(綜述)，張鐵輝(審校)

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，黑龍江 大慶 163316)

男性不育癥是指同居1年以上未采取任何避孕措施，由男性因素而使女方未能妊娠的不育癥，約占所有不育不孕癥比例的50%[1]。精子DNA損傷、精子活動(dòng)下降與精子密度降低被認(rèn)為是影響精子質(zhì)量、致使男性不育的主要原因。而精子細(xì)胞凋亡率與上述因素關(guān)系密切，也可作為潛在的衡量精液質(zhì)量和男性生育能力的一個(gè)重要臨床指標(biāo)。細(xì)胞凋亡是某些特定因素將機(jī)體內(nèi)預(yù)存的死亡程序激活引起細(xì)胞的主動(dòng)性死亡，亦稱程序性細(xì)胞死亡，其可由激素變化、輻射、疾病等諸多因素誘發(fā)。而誘發(fā)細(xì)胞凋亡存在3條途徑，分別為線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑、死亡受體介導(dǎo)的凋亡途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑，其中線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與精子發(fā)生發(fā)育、精子質(zhì)量、精子受精能力的關(guān)系尤為密切[2]。近年來對(duì)男性不育的研究中，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑正在逐步被人們認(rèn)知。

1 線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要細(xì)胞器,其參與三磷酸腺苷(ATP)合成，活性氧類(reactive oxygen species,ROS)的產(chǎn)生，鈣信號(hào)的調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡的介導(dǎo)。

1.1線粒體與細(xì)胞凋亡概述 在正常情況下，線粒體所產(chǎn)生的能量能夠有效地供應(yīng)細(xì)胞進(jìn)行正常的應(yīng)答反應(yīng)；當(dāng)刺激強(qiáng)度超出正常細(xì)胞可耐受的極限時(shí)，線粒體所產(chǎn)生的能量反而誘發(fā)細(xì)胞發(fā)生凋亡，以保證機(jī)體在最小損失的情況下結(jié)束細(xì)胞的生命進(jìn)程[3]。線粒體在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮樞紐性作用，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放引起的跨膜電位下降出現(xiàn)在染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂等細(xì)胞核凋亡特征出現(xiàn)之前，而線粒體一旦發(fā)生崩潰，則細(xì)胞凋亡的過程便不可逆轉(zhuǎn)。參與凋亡相關(guān)的線粒體蛋白主要有：細(xì)胞色素C、B細(xì)胞淋巴瘤基因2(B-cell lymphoma gene 2，Bcl-2)家族蛋白、凋亡誘導(dǎo)因子、天冬氨酸蛋白酶(caspase)家族。

1.2線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制 線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑主要與定位于或受信號(hào)刺激后轉(zhuǎn)移到線粒體外膜的Bcl-2蛋白家族有關(guān),Bcl-2與Bax分別作為Bcl-2基因家族細(xì)胞生存基因和死亡基因的代表。主要表達(dá)在線粒體上的Bcl-2蛋白，通過抑制干擾ROS的產(chǎn)生和減少脂膜過氧化的方式來發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用；Bax蛋白則可以通過直接插入線粒體膜,引起細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞質(zhì)而誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡。線粒體主要通過Bcl-2與Bax兩者表達(dá)的平衡來調(diào)節(jié)其通透性轉(zhuǎn)換孔的開放與關(guān)閉，以此調(diào)控線粒體跨膜電位。Bax等促凋亡蛋白表達(dá)過量時(shí)，線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放后，繼而線粒體跨膜電位下降，經(jīng)過ATP/dATP參與，使細(xì)胞色素C釋放進(jìn)入胞質(zhì)與凋亡酶激活因子相結(jié)合。凋亡酶激活因子可以激活caspase-9的前體蛋白，促使其自我剪切形成有活性的caspase-9蛋白酶，進(jìn)而啟動(dòng)一系列的caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)[4],Bcl-2蛋白家族和Ca2+信號(hào)聯(lián)系密切，如Bcl-2蛋白家族能改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+容量及在受刺激時(shí)Ca2+的釋放速度，通過調(diào)節(jié)Ca2+信號(hào)間接調(diào)控細(xì)胞凋亡。由于線粒體基質(zhì)的高滲性可以增大Ca2+攝取量，使線粒體內(nèi)的Ca2+濃度超過線粒體容納量的極限，引起線粒體外膜腫脹，最終導(dǎo)致其外膜的破裂，膜內(nèi)間質(zhì)溢出，促凋亡蛋白釋放,發(fā)生細(xì)胞凋亡。另一方面在caspase非依賴性的細(xì)胞凋亡途徑中，線粒體中的凋亡誘導(dǎo)因子和限制性內(nèi)切核酸酶G受到凋亡信號(hào)刺激后從線粒體內(nèi)釋放，經(jīng)細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核，對(duì)細(xì)胞核DNA進(jìn)行切割[5]。

2 線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與生精細(xì)胞

在精原細(xì)胞形成成熟精子的過程中，經(jīng)過精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子形成，使睪丸生精細(xì)胞核和包括線粒體在內(nèi)的細(xì)胞器發(fā)生急劇變化。而生精細(xì)胞中線粒體的供能功能也發(fā)生了變化：①在睪丸中，其可以為生精細(xì)胞的發(fā)生、分化和成熟提供能量；②在射精后的精子中，線粒體則為精子的活動(dòng)供能。同時(shí)，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在睪丸生精細(xì)胞、成熟的精子中的作用也略有差異。

2.1睪丸生精細(xì)胞中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用 在睪丸中，機(jī)體主要以細(xì)胞凋亡的方式來清除染色體畸形或受損的生精細(xì)胞，保持生殖細(xì)胞與支持細(xì)胞比率，從而確保正常精子的質(zhì)量和數(shù)量[6]。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑在控制睪丸生精細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Vera等[7]在熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在FasL和Fas功能缺失(即介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的死亡受體途徑被阻斷)的小鼠中,睪丸生精細(xì)胞的凋亡仍然存在，而在對(duì)熱敏感野生型小鼠生精細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn),Bax從胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核外,同時(shí)與在細(xì)胞核外的線粒體聚集,促使細(xì)胞色素C的釋放,從而導(dǎo)致caspase-3的激活,提示線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是熱應(yīng)激誘導(dǎo)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

2.2精子中線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用 精子凋亡形態(tài)學(xué)特點(diǎn)可以表現(xiàn)為精子頭部核異常、染色質(zhì)固縮、質(zhì)膜內(nèi)磷脂酰絲氨酸外翻、膜起泡和凋亡小體的形成；但由于精子結(jié)構(gòu)區(qū)域化、精子核染色質(zhì)致密且其周圍存在魚精蛋白保護(hù)，使凋亡誘導(dǎo)因子和限制性內(nèi)切核酸酶G難以到達(dá)核基因組，因此并非所用凋亡的精子都呈現(xiàn)體細(xì)胞凋亡那樣典型的DNA片段化的結(jié)果[8]。在臨床檢測(cè)精子凋亡時(shí)通常可觀察到精子頭部凋亡的精子和其頸部中段凋亡的精子，提示位于精子頭部的核DNA和精子頸部的線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)發(fā)生損傷。Smith等[9]研究發(fā)現(xiàn)，精子只有處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下,線粒體產(chǎn)生的過多ROS才能誘導(dǎo)細(xì)胞的DNA損傷；隨后堿基切除修復(fù)酶OGG1被激活，裂解其因氧化而產(chǎn)生的堿基空缺；在ROS、脂肪醛和活化的caspase酶作用下導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，同時(shí)使磷脂酰絲氨酸外翻，在此狀態(tài)下細(xì)胞凋亡啟動(dòng)后的48 h，通過原位缺口末端標(biāo)記法使凋亡的精子帶有陽性標(biāo)記，提示精子凋亡與線粒體產(chǎn)生的ROS關(guān)系密切，而線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能參與造成細(xì)胞核DNA的堿基空缺，染色質(zhì)解聚的過程。

3 線粒體介導(dǎo)細(xì)胞凋亡與男性不育

精子DNA損傷、精子活動(dòng)下降和精子數(shù)量減少等因素影響精子的受精能力，諸多因素的綜合作用結(jié)果導(dǎo)致男性不育。線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路的發(fā)現(xiàn)與導(dǎo)致男性不育這個(gè)病理生理過程的機(jī)制成為研究的熱點(diǎn)。

3.1精子DNA損傷 精子DNA 損傷對(duì)生育的影響涉及到受精、卵裂、植入以及胚胎存活等諸多環(huán)節(jié)[10]，已被認(rèn)為是一個(gè)新的評(píng)價(jià)精液質(zhì)量和預(yù)測(cè)生育能力的指標(biāo)[11]。精子DNA損傷可以引起線粒體的氧化呼吸鏈功能障礙。鄭九嘉等[12]對(duì)34例不同活力的精液標(biāo)本研究，應(yīng)用氧電極法測(cè)定精子線粒體呼吸功能，使用精子染色質(zhì)擴(kuò)散方法來檢測(cè)精子損傷，發(fā)現(xiàn)精子DNA損傷程度與線粒體呼吸、氧化磷酸化功能之間存在緊密的聯(lián)系；精子DNA損傷與線粒體狀態(tài)Ⅲ呼吸耗氧、氧化磷酸化效率均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，提示精子DNA損傷程度越高,核基因和線粒體基因缺陷或變異就越嚴(yán)重，越可能嚴(yán)重地破壞線粒體的氧化呼吸功能；如果線粒體呼吸功能發(fā)生異常很容易造成線粒體膜電位下降,使ROS生成量增加,產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng),破壞呼吸鏈的正常運(yùn)轉(zhuǎn)，導(dǎo)致能量障礙,改變線粒體膜電位并增加內(nèi)膜通透性，導(dǎo)致膜損傷，釋放細(xì)胞色素C，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡。

3.2精子活動(dòng)力下降 精子活動(dòng)力是衡量精液質(zhì)量和男性生育力的重要指標(biāo)，精子活動(dòng)力低下可能導(dǎo)致不育。研究發(fā)現(xiàn)[13]，不育癥組患者的精子中caspase-3 和caspase-8的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組，且精子中caspase-8的平均水平與精子活動(dòng)性呈負(fù)相關(guān)，研究證實(shí)精子凋亡與精子活力密切相關(guān)，是評(píng)價(jià)男性不育的指標(biāo)之一。

精子通過擺動(dòng)尾部的鞭毛方式運(yùn)動(dòng)，而線粒體存在其尾部中段，正常情況下,精子通過無氧酵解產(chǎn)生ATP；而射精后，精子通過線粒體呼吸鏈氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP為其運(yùn)動(dòng)供能，線粒體任何結(jié)構(gòu)與功能的改變都會(huì)影響到精子的運(yùn)動(dòng)能力[14]。Barroso等[15]研究發(fā)現(xiàn)，形態(tài)正常但活動(dòng)力低下的精子線粒體膜電位下降顯著，凋亡率顯著增高，而且不同活動(dòng)力的精子凋亡率和線粒體膜電位損傷率之間存在高度的相關(guān)性，即精子凋亡率越高，其線粒體膜電位損傷率也就越大。同時(shí)大量研究證實(shí)[12，16]，精子活動(dòng)力低下與精子DNA損傷密切相關(guān)，尤其是參與線粒體中多種肽的精子mtDNA；在過量的ROS作用下，缺乏組蛋白等保護(hù)性蛋白且自身修復(fù)損傷能力差的mtDNA的單鏈或雙鏈可發(fā)生頻繁斷裂，致使mtDNA突變將破壞線粒體氧化磷酸化所需的合成蛋白，影響線粒體的呼吸功能，致使精子的活動(dòng)力下降。研究發(fā)現(xiàn)[17]，弱精子癥患者中，精子mtDNA中可發(fā)生突變，突變點(diǎn)為線粒體ATPase6基因上的T8821C點(diǎn)，該突變改變線粒體中氨基酸的編碼，導(dǎo)致線粒體氧化呼吸鏈功能障礙，使精子的活動(dòng)力降低；線粒體呼吸功能受損可以同時(shí)誘發(fā)細(xì)胞凋亡，提示線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與精子的活動(dòng)力可能存在直接或間接的聯(lián)系。

3.3精子密度降低 精子密度反映每毫升中精子的數(shù)量，與男性生育力關(guān)系密切。呂逸清等[18]研究發(fā)現(xiàn)，少精子癥組精子細(xì)胞凋亡率顯著低于對(duì)照組，精子凋亡率與精子密度之間呈顯著負(fù)相關(guān)。精子發(fā)生是一個(gè)受到精密調(diào)控并具備周期性的動(dòng)態(tài)過程，包括精原細(xì)胞有絲分裂、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精細(xì)胞分化成精子。當(dāng)睪丸微環(huán)境不支持精子發(fā)生時(shí)，可激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑，使睪丸中各級(jí)生精細(xì)胞大量凋亡。這可能是決定實(shí)際產(chǎn)生的精子數(shù)量少于精子應(yīng)生成量的主要原因之一。

研究發(fā)現(xiàn)[19]，在雙酚A誘導(dǎo)下的青春期小鼠生精細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)中，在雙酚A暴露的小鼠睪丸中的Bax和caspase-9的表達(dá)水平明顯上調(diào)，使線粒體釋放細(xì)胞色素C進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),進(jìn)而使caspase-8和caspase-3表達(dá)水平升高，提示雙酚A可誘使青春期小鼠的睪丸生精細(xì)胞通過線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑發(fā)生細(xì)胞凋亡。張端等[20]在精索靜脈曲張可致睪丸組織缺氧損傷的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)增加，并且發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子1α表達(dá)伴隨病程進(jìn)展持續(xù)上調(diào)，促使Bcl-2表達(dá)降低以及Bax表達(dá)升高，使睪丸生精細(xì)胞凋亡增加，進(jìn)而影響睪丸的生精功能，提示缺氧可明顯影響線粒體氧化呼吸功能，改變Bcl-2和Bax基因表達(dá)的水平來誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞凋亡，影響睪丸生精功能。綜上所述，模擬各種可能導(dǎo)致男性不育的疾病的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了睪丸中生精細(xì)胞與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑密切相關(guān)，可能影響精子生成數(shù)量，繼而改變精子密度，可能導(dǎo)致男性不育癥。

4 展 望

線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑參與精子的發(fā)生、分化、成熟，影響精子的質(zhì)量及活動(dòng)力，其與男性生育能力密切相關(guān)。在大多數(shù)男性不育患者中，ROS水平升高、線粒體損傷功能障礙與精子凋亡率正相關(guān)。隨著研究的不斷深入，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑在男性不育中的重要性。近年來，在男性不育的研究中發(fā)現(xiàn)男性生殖細(xì)胞線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與各種細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、JNK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等)存在聯(lián)系，但其與其他信號(hào)途徑之間的關(guān)系尚未闡明。深入研究線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與其他通路的區(qū)別和聯(lián)系可從機(jī)制水平上進(jìn)一步認(rèn)識(shí)男性不育癥，并為臨床治療提供充分的理論依據(jù)。

[1] Matzuk MM,Lamb DJ.The biology of infertility:research advances and clinical challenges[J].Nat Med,2008,14(11):1197-1213.

[2] Sousa AP,Amaral A,Baptista M,etal.Not all sperm are equal:functional mitochondria characterize a subpopulation of human sperm with better fertilization potential[J].PLoS One,2011,6(3):e18112.

[3] Cheng S,Gao N,Zhang Z,etal.Quercetin induces tumor-selective apoptosis through down-regulation of Mcl-1 and activation of Bax[J].Clin Cancer Res,2010,16(23):5679-5691.

[4] Eno CO,Eckenrode EF,Olberding KE,etal.Distinct roles of mitochondria-and ER-localized Bcl-xL in apoptosis resistance and Ca2+homeostasis[J].Mol Bio Cell,2012,23(13):2605-2618.

[5] Suen DF,Norris KL,Youle RJ.Mitochondrial dynamics and apoptosis[J].Gene Dev,2008,22(12):1577-1590.

[6] Kim ED,Barqawi AZ,Seo JT,etal.Apoptosis:its importance in spermatogenic dysfunction[J].Urol Clin North Am，2002,29(4):755-765.

[7] Vera Y,Diaz-Romero M,Rodriguez S,etal.Mitochondria-dependent pathway is involved in heat-induced male germ cell death:lessons from mutant mice[J].Biol Reprod,2004,70(5):1534-1540.

[8] Anand-Ivell R,Ivell R.The special systems biology of the sperm[J].Biochem J,2011,436(3):e3-e5.

[9] Smith TB,Dun MD,Smith ND,etal.The presence of a truncated base excision repair pathway in human spermatozoa,mediated by OGG1[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 6):1488-1497.

[10] Shamsi MB,Kumar R,Dada R.Evaluation of nuclear DNA damage in human spermatozoa in men opting for assisted reproduction[J].Indian J Med Res,2008,127(2):115-123.

[11] Schulte RT,Ohl DA,Sigman M,etal.Sperm DNA damage in male infertility:etiologies,assays,and outcomes[J].J Assist Reprod Genet,2010,27(1):3-12.

[12] 鄭九嘉,樓哲豐,鄭蔚虹,等.線粒體呼吸功能與精子和活力、核DNA損傷的相關(guān)性分析[J].中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2012,34(1):34-40.

[13] 魏小斌,李啟星,白志明,等.不育癥患者精液中Caspase-3和Caspase-8檢測(cè)的臨床意義[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,2013,23(14):49-53.

[14] Rajender S,Rahul P,Mahdi AA.Mitochondria,spermatogenesis and male infertility[J].Mitochondrion,2010,10(5):419-428.

[15] Barroso G,Taylor S,Morshedi M,etal.Mitochondrial membrane potential integrity and plasma membrane translocation of phosphatidylserine as early apoptotic markers:a comparison of two different sperm subpopulations[J].Fertil Steril,2006,85(1):149-154.

[16] 莊東明,趙英會(huì),于廣福,等.大腸埃希菌體外感染對(duì)人精子運(yùn)動(dòng)參數(shù)超微結(jié)構(gòu)和細(xì)胞凋亡的影響[J].中國病原生物學(xué)雜志,2013,8(4):318-321.

[17] Güney AI,Javadova D,Klrac D,etal.Detection of Y chromosome microdeletions and mitochondrial DNA mutations in male infertility patients[J].Genet Mol Res,2012,11(2):1039-1048.

[18] 呂逸清,陳斌,胡凱,等.精子凋亡率和精子密度、活率、活力及活性氧關(guān)系探討[J].中國男科學(xué)雜志,2009,23(2):34-37.

[19] Wang Q,Zhao XF,Ji YL,etal.Mitochondrial signalling pathway is also involved in bisphenol A induced germ cell apoptosis in testes[J].Toxicol Lett,2010,199(2):129-135.

[20] 張端,張雁鋼,李超鵬,等.精索靜脈曲張對(duì)青春期大鼠生精細(xì)胞HIF-1α、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].中國醫(yī)療前沿,2011,6(5):34-35.