韓 冬，蔣經(jīng)柱，肖 亮(綜述)，周漢新※(審校)

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣州 510182； 2.深圳市第二人民醫(yī)院普外科，廣東 深圳 518035； 3.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東 汕頭 515041)

腫瘤疾病嚴(yán)重威脅著人類健康，化療是腫瘤治療的重要方法之一，然而同時產(chǎn)生的腫瘤多藥耐藥嚴(yán)重影響了化療的效果。為了進一步研究多藥耐藥產(chǎn)生的機制，多藥耐藥細(xì)胞株的生物學(xué)特性，乃至逆轉(zhuǎn)多藥耐藥，首先需要在體外建立穩(wěn)定的腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株。體外建立腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株方法較多，可選取該類腫瘤臨床治療常用的任意一種化療藥物，包括沖擊誘導(dǎo)法、濃度遞增誘導(dǎo)法或結(jié)合兩法使用?，F(xiàn)就不同類型腫瘤使用不同藥物誘導(dǎo)腫瘤多藥耐藥細(xì)胞株的方法予以綜述。

1 肝癌多藥耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)方法

1.1使用阿霉素誘導(dǎo) 翟寶進等[1]將對數(shù)生長期肝癌HepG2細(xì)胞制備成密度為1×108/L的單細(xì)胞懸液。培養(yǎng)液中加入不同濃度的阿霉素，藥物濃度梯度分別為1、5、10、50、100、500 μg/L和1×103μg/L,在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱環(huán)境中持續(xù)培養(yǎng)，歷時4個月，最終使細(xì)胞能在含濃度為1×103μg/L的阿霉素培養(yǎng)液中生存并傳代，將得到人肝癌細(xì)胞耐藥模型命名為HepG2/Adm細(xì)胞。用含10%熱滅活胎牛血清和1×105U/L青霉素、鏈霉素的高糖培養(yǎng)液來培養(yǎng)HepG2肝癌細(xì)胞系[2]，當(dāng)大部分HepG2細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，使其暴露在濃度逐漸增加的含阿霉素的培養(yǎng)液中，最終使其能在濃度為100 μg/L的阿霉素培養(yǎng)液中生長、傳代[3]。Zhong等[4]使用濃度梯度遞增法，在體外建立了肝癌Bel-7402細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞株模型。將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞濃度為5×108/L的Bel-7402肝癌細(xì)胞接種和培養(yǎng)在25 mL的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)24 h。再將培養(yǎng)液替換為含低濃度阿霉素(10 μg/L)的培養(yǎng)液中，使用含藥液培養(yǎng)24 h后，棄去含藥培養(yǎng)液，細(xì)胞消化、傳代并以1×108/L的細(xì)胞濃度重新接種在25 mL培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)使用不含阿霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期，增加藥物濃度使細(xì)胞存活率達(dá)60%～70%。重復(fù)多次，用時約6個月，藥物濃度不斷增加，直到細(xì)胞能在含濃度為0.5×103μg/L阿霉素的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長和增殖，將此細(xì)胞命名為Bel-7402/ADMv。Wang等[5]用阿霉素濃度從0.1 μmol/L的培養(yǎng)液開始，經(jīng)過長時間逐步誘導(dǎo)直至藥物終濃度達(dá)100 μmol/L，并將得到的人肝癌耐藥株培養(yǎng)維持在濃度為1.2 μmol/L的阿霉素培養(yǎng)液中，以此維持細(xì)胞耐藥性。

1.2使用氟尿嘧啶誘導(dǎo) Gu等[6]將肝癌BEL-7402細(xì)胞在濃度為0.1 μmol/L含氟尿嘧啶的培養(yǎng)液中培養(yǎng)5 d,之后去除漂浮的死細(xì)胞和含氟尿嘧啶的培養(yǎng)液,存活下來的細(xì)胞用不含藥而是含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長到占全部的60%～70%時,使用濃度為10 μmol/L的氟尿嘧啶培養(yǎng)液沖擊培養(yǎng)24 h。之后存活的細(xì)胞在不含藥的培養(yǎng)液中培養(yǎng),如此反復(fù),同時不斷提高藥物濃度，直到細(xì)胞能在1 μmol/L含藥培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長并傳代。使用這種逐漸增加藥物濃度方式結(jié)合間歇性高濃度沖擊方法，用時約10個月,順利誘導(dǎo)出耐藥肝癌細(xì)胞株BEL-7402/氟尿嘧啶。

1.3使用順鉑誘導(dǎo) 順鉑也常被用來誘導(dǎo)肝癌多藥耐藥細(xì)胞株，采用藥物濃度逐步遞增間歇作用的方法來誘導(dǎo)。用含順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)對數(shù)生長期人肝癌QGY細(xì)胞，藥物從100 μg/L低濃度開始，培養(yǎng)48 h后棄去含藥培養(yǎng)液，加入新鮮不含藥培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長活性恢復(fù)正常，消化傳代后繼續(xù)用含濃度為100 μg/L的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，反復(fù)多次用含藥培養(yǎng)液，并逐步提高順鉑濃度，最終獲得能耐受濃度為500 μg/L順鉑培養(yǎng)液的細(xì)胞QGY/順鉑，并使用含100 μg/L順鉑的培養(yǎng)液持續(xù)培養(yǎng)QGY/cDDP細(xì)胞[7]。Zhou等[8]用含1×105U/L青-鏈雙抗，10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)肝癌SK-Hep1細(xì)胞，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用高濃度的順鉑培養(yǎng)24 h，進行篩選，培養(yǎng)液中順鉑終濃度為0.5 μmg/L，之后用PBS液沖洗，并用不含順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)，1～2 d后換液，之后在其對數(shù)生長期再用5×103μg/L順鉑培養(yǎng)液進行沖擊，反復(fù)如此，最終使該細(xì)胞系能在10 μg/L順鉑培養(yǎng)液中生長并傳代。Ling等[9]將人肝癌細(xì)胞系SK-Hep1細(xì)胞維持在含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液中，并加入1×105U/L青霉素和1×105U/L鏈霉素，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化、細(xì)胞傳代。當(dāng)SK-Hep1細(xì)胞處于對數(shù)生長期時，換用含濃度為5×103μg/L的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后棄掉含藥培養(yǎng)液，用PBS液沖洗3次后，換用新鮮的培養(yǎng)液。2 d后去除死掉的懸浮細(xì)胞，繼續(xù)用含順鉑濃度為5×103μg/L的培養(yǎng)液再次進行沖擊，與之前方法相同重復(fù)5次，這樣算是一次沖擊過程。每兩個沖擊過程后，將一小部分細(xì)胞收集和冷凍保存在不含藥培養(yǎng)液中，存活細(xì)胞繼續(xù)進行接下來再一次的誘導(dǎo)，整個過程持續(xù)6個月，最后得到3個耐藥細(xì)胞系，它們對于順鉑的耐藥指數(shù)分別為5.14、8.66、14.25。然后將耐藥細(xì)胞保持在含有10 μg/L順鉑的完全培養(yǎng)液中，用耐藥細(xì)胞株做實驗之前的3周換用不含順鉑的培養(yǎng)液。

選用濃度遞增法、沖擊誘導(dǎo)法[8,10]或兩法結(jié)合，都可成功獲得肝癌多藥耐藥株。而培養(yǎng)時加入黃芪多糖[11]，在體外可以提高某些化療藥物、如環(huán)磷酰胺、阿霉素、氟尿嘧啶、順鉑、足葉乙甙、長春新堿對H22肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性。黑色素瘤分化相關(guān)基因7/白細(xì)胞介素24能使氟尿嘧啶和阿霉素對肝癌耐藥細(xì)胞的細(xì)胞毒作用增強[12]，多藥耐藥相關(guān)信使RNA和蛋白表達(dá)水平降低。

2 肺癌多藥耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)方法

2.1沖擊法結(jié)合濃度遞增法 肺癌耐藥株多用順鉑誘導(dǎo)，陳杰等[13]將大劑量沖擊誘導(dǎo)法與逐步增加劑量誘導(dǎo)法相結(jié)合，測定A549細(xì)胞對順鉑的最低耐受濃度后，使用終濃度為2×103μg/L的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞24 h，之后更換培養(yǎng)液，用含相同濃度的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)7 d，細(xì)胞穩(wěn)定生長后傳代，再次用含終濃度為2×103μg/L的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)A549細(xì)胞24 h后，更換新的含較高濃度的順鉑培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7～10 d，待細(xì)胞穩(wěn)定生長后傳代，之后逐漸增加順鉑濃度，每次增加濃度之前，都使用終濃度為2×103μg/L的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，最終使A549細(xì)胞能在濃度2×103μg/L順鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長和傳代，得到A549耐藥細(xì)胞株用時6個月。

2.2濃度遞增法 李艷萍等[14]采用濃度梯度遞增法誘導(dǎo)，使用小劑量含卡鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)處于對數(shù)生長期肺癌A549細(xì)胞，存活細(xì)胞生長較慢，細(xì)胞大部分死亡，等細(xì)胞生長活性、倍增時間恢復(fù)后，再增加卡鉑劑量，直至用終濃度為4×103μg/L卡鉑的培養(yǎng)液。細(xì)胞穩(wěn)定生長并恢復(fù)至原來倍增時間后，用不含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)1周。歷時180 d培養(yǎng)得到耐藥株，將耐藥細(xì)胞株命名為A549/CARP細(xì)胞。Sun等[15]用紫杉醇濃度遞增法，用時8個月，培養(yǎng)液中紫杉醇濃度從5×103ng/L逐步增加到1×106ng/L，最終獲得耐藥株。潘永成等[16]先測定順鉑對肺癌A549細(xì)胞半數(shù)抑制濃度[(4.33±0.41) μmol/L]，用初始濃度為4×103μmol/L的順鉑培養(yǎng)液誘導(dǎo)，逐步提高順鉑濃度，直至肺癌細(xì)胞能在含濃度為4×104μmol/L順鉑培養(yǎng)液中穩(wěn)定并良好生長、傳代[17]，最終得到人肺癌耐藥細(xì)胞模型A549/順鉑。

2.3沖擊法 王濤等[18]采用順鉑大劑量間歇誘導(dǎo)法誘導(dǎo)人大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株H460細(xì)胞，建立肺癌多藥耐藥細(xì)胞株H460/順鉑。用含終濃度為4×103μmol/L順鉑的培養(yǎng)液培養(yǎng)沖擊處于對數(shù)生長期的人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞，培養(yǎng)1 h后棄去含藥培養(yǎng)液，經(jīng)沖洗、胰酶消化后，以1×107/L細(xì)胞濃度接種于不含藥的新培養(yǎng)瓶中，第2日仍用不含藥培養(yǎng)液換液。待細(xì)胞逐漸長至70%～80%滿瓶時再次用含藥培養(yǎng)液沖擊，同樣方法反復(fù)多次沖擊，抗藥性檢測同時進行，反復(fù)凍存、復(fù)蘇，觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及其穩(wěn)定性，最終用時180 d獲得多藥耐藥細(xì)胞株H460/順鉑。只用沖擊法，用終濃度100 μmol/L順鉑培養(yǎng)液沖擊對數(shù)生長期肺癌細(xì)胞，1 h后換用不含藥培養(yǎng)液，待細(xì)胞恢復(fù)活性，再次沖擊，較為快速地得到了具有耐藥性的細(xì)胞株[19]。為了保持人肺腺癌耐順鉑細(xì)胞株耐藥性，用含2×103μg/L的順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)，使用前2 d換用不含藥培養(yǎng)液[20-21]，而姜黃素的加入對肺癌耐藥細(xì)胞的耐藥性具有逆轉(zhuǎn)作用[22]。

3 其他種類癌細(xì)胞多藥耐藥細(xì)胞株的誘導(dǎo)方法

Jiang等[23]將乳腺癌BCap37細(xì)胞株在含紫杉醇的培養(yǎng)液中培養(yǎng)72 h，使用的紫杉醇劑量逐步遞增，濃度范圍5～100 nmol/L(5,10,20,50,100 nmol/L)，各劑量誘導(dǎo)重復(fù)3次。在使用下一個含更高的濃度紫杉醇培養(yǎng)液前，存活的細(xì)胞在不含紫杉醇培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到的細(xì)胞在濃度為200 nmol/L紫杉醇培養(yǎng)液中培養(yǎng)，直至細(xì)胞能在該濃度環(huán)境中正常生長，得到耐藥細(xì)胞系Bads-200。同時，他們使用沖擊誘導(dǎo)方法，用含200 nmol/L濃度紫杉醇的培養(yǎng)液，使用時間范圍0.5～48 h(0.5,1,2,4,12,24,48 h)。每種不同時間也是重復(fù)3次，在使用下一個時間段之前，用不含藥培養(yǎng)液來培養(yǎng)存活下來的細(xì)胞，為進一步鞏固誘導(dǎo)效果，用含200 nmol/L濃度紫杉醇的培養(yǎng)液將先前篩得的細(xì)胞培養(yǎng)72 h，得到耐藥細(xì)胞系命名為Bats-72，而且他們發(fā)現(xiàn)兩種誘導(dǎo)方式得到的耐藥株展現(xiàn)出不同多藥耐藥表型。采用未經(jīng)化療的胃癌患者術(shù)后得到的人胃癌細(xì)胞系OCUM-2M也可用來建立耐藥腫瘤細(xì)胞株[24]，在5% CO2、37 ℃的環(huán)境中，用含1×105U/L青霉素、1×105μg/L鏈霉素、10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)。用氟尿嘧啶濃度為其IC50的1/160的培養(yǎng)液開始誘導(dǎo)，每2周將藥物濃度增加25%，最后得到能在高濃度藥物環(huán)境中倍增的OCUM-2M/氟尿嘧啶細(xì)胞系。Liu等[25]使用奧沙利鉑來誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞，使用濃度遞增法，最終獲得能在含奧沙利鉑的培養(yǎng)液中穩(wěn)定生長的耐藥細(xì)胞株。Wen等[26]用順鉑沖擊食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系EC109，用濃度為25 μmol/L順鉑培養(yǎng)液培養(yǎng)EC109細(xì)胞2 h，然后換用不含順鉑的培養(yǎng)液，等細(xì)胞到達(dá)對數(shù)生長期后，再重復(fù)沖擊，6次循環(huán)。EC109細(xì)胞和EC109/順鉑細(xì)胞用含10% FBS，1×105U/L的青霉素、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)，成功得到具有多藥耐藥性EC109/順鉑細(xì)胞。

4 結(jié) 語

誘導(dǎo)不同種類的腫瘤細(xì)胞成為多藥耐藥株時，針對不同類型腫瘤可采用不同誘導(dǎo)方案，既可以使用濃度梯度遞增法，也可使用濃度沖擊法，而誘導(dǎo)選擇的藥物也不盡相同。選擇濃度梯度法一般需耗時較長，但得到的耐藥細(xì)胞株的穩(wěn)定性較好，沖擊法相對用時少，因此也有學(xué)者將兩法結(jié)合取得良好效果，篩選誘導(dǎo)得到的耐藥細(xì)胞株穩(wěn)定性還有待進一步研究，便于下一步研究應(yīng)用。然而，這些誘導(dǎo)方法雖然用的誘導(dǎo)藥物不盡相同，但是多用一種藥物來誘導(dǎo)，與實際臨床化療方案相差較大，接近臨床化療方案的誘導(dǎo)方式效果如何，同時是否能用更短的時間得到穩(wěn)定耐藥株，還有待進一步探索研究。

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