周廣麒 陸 晨 金 華 姜國斌 鄒吉祥

(大連工業(yè)大學(xué)，大連，116034) (大連民族學(xué)院)

毛白楊(Populus tomentosa carr)是我國優(yōu)良的速生樹種之一，具有生長快、樹干通直挺拔、冠形美等特點(diǎn)，是優(yōu)良的綠化造林樹種。但是毛白楊硬枝扦插不易生根，造成其育苗費(fèi)時費(fèi)力、成苗率低［1］，一直是林業(yè)生產(chǎn)上急需解決的關(guān)鍵問題。芽變毛白楊(Populus tomentosa carr)是在毛白楊硬枝扦插過程中發(fā)現(xiàn)的一變異單株，其扦插生根容易，成活率高［2］，研究其插穗不定根發(fā)生分子機(jī)理，對解決毛白楊扦插生根問題、縮短育種周期、改良遺傳品質(zhì)、推動毛白楊這一優(yōu)良樹種在林業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用具有重要意義。

突變體芽變毛白楊的獲得，不僅用于楊樹育種和硬枝扦插生根的研究，也為直接研究其不定根發(fā)生的分子機(jī)理提供了寶貴的材料。蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是研究突變體和野生型之間差異性的強(qiáng)有力工具。Yang 等［3］以2，4－D 處理水稻，研究生長激素對水稻不定根發(fā)育的影響，認(rèn)為高豐度的EF－1beta’蛋白對水稻不定根的形成和發(fā)育有著重要的影響。Sorin［4］在研究擬南芥突變體時，采用雙向電泳技術(shù)找到了11 種與不定根原基數(shù)量相關(guān)的蛋白質(zhì)。劉穎麗［5］對核桃成熟子葉不定根發(fā)生過程中的相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)在不定根分化期有44 個蛋白質(zhì)上調(diào)表達(dá)，45 個蛋白質(zhì)下調(diào)表達(dá)，108 個蛋白質(zhì)基本不變。韓華［6］以雜種落葉松插穗莖段為研究材料，采用蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)，分析探討了不同無性系不定根發(fā)生過程中表達(dá)的蛋白質(zhì)，共鑒定了75個差異表達(dá)蛋白。劉桂豐等［7］利用雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，對黑林1 號楊組培葉片不定根發(fā)生誘導(dǎo)階段和根原基形成階段的蛋白進(jìn)行分析，推測環(huán)氧化物水解酶ATsEH 和RNA 依賴型RNA 聚合酶SDE1 可能與黑林1 號楊組培葉片不定根原基形成和分化有關(guān)。本文以突變體芽變毛白楊和野生型毛白楊為研究材料，利用熒光雙向電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)，尋找與芽變毛白楊插穗不定根形成有關(guān)的蛋白質(zhì)，探討這些蛋白在芽變毛白楊不定根發(fā)生過程中表達(dá)水平的變化規(guī)律，以及在不定根形成和發(fā)育中的功能和作用，為培育出更多的易生根優(yōu)良毛白楊奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

植物材料:芽變毛白楊和野生型毛白楊均采自大連大學(xué)。

主要試劑:尿素(Urea)、硫脲(Thiourea)、Tris 堿(Tris－Base)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、固定相pH 干膠條(24 cm，pH值為3 ～11)、IPG 緩沖液(pH 值為3 ～11)、2D Clean－Up Kit、2D－Quant Kit、CyDye DIGE Fluor minimal labeling Kit 均購自GE Healthcare 公司，二甲基甲酰胺(DMF)、賴氨酸(L－lysine)購自Sigma－Aldrich 公司。

主要儀器:EttanTM等電聚焦電泳儀、EttanTM垂直板電泳儀、MultiTemP III 溫控循環(huán)水浴系統(tǒng)、Typhoon 9400 多功能熒光掃描系統(tǒng)、Image Quant 圖像分析軟件、DeCyder 凝膠分析軟件均為GE Healthcare 公司產(chǎn)品，4800 MALDI－ TOF/TOF 質(zhì)譜儀為Applied Biosystem 公司產(chǎn)品。

1.1 插穗處理

將4月份生長于室外的芽變毛白楊(突變體)和毛白楊(野生型)1年生枝條(粗細(xì)相近、長勢一致)由基部開始剪成18 cm 的插穗［8］，分3 種扦插處理。

A 組突變體誘導(dǎo)生根:將芽變毛白楊插穗插入培養(yǎng)床中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，白天18 ℃，晚上12 ℃，光照12 h/d，相對濕度維持在85%左右，誘導(dǎo)插穗生根。

B 組突變體抑制生根:將芽變毛白楊插穗插入培養(yǎng)床中，置于冰箱中4 ℃培養(yǎng)1 ～3 d，然后置于光照培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)(消除低溫脅迫的生理影響)，其他同A 組。

C 組野生型誘導(dǎo)生根:將野生型毛白楊插穗插入培養(yǎng)床中，其他同A 組。

1.2 蛋白樣品制備

采用三氯乙酸—丙酮沉淀法提取插穗蛋白:切取插穗培養(yǎng)12 d 后插穗下端0 ～3 cm 處(木質(zhì)部以外)的皮部，在液氮中充分研磨成粉末，加入樣品3倍體積的提取液(含10%三氯乙酸的丙酮溶液)，混勻后在－20 ℃的條件下充分沉淀，分裝于1.5 mL離心管中，4 ℃，15 000 r/min 離心30 min，棄去上清液，沉淀重懸浮于等體積的－20 ℃預(yù)冷的丙酮中，4 ℃，15 000 r/min 離心30 min，棄去上清液，重復(fù)洗滌離心，沉淀物真空干燥后，向蛋白干粉中加入500 μL 蛋白裂解液(7 mol/L 尿素，2 mol/L 硫脲，4% CHAPS，40 mmol/L Tris－Base)，在室溫下超聲5 min，再4 ℃，15 000 r/min 離心15 min，取上清液至新的1.5 mL 離心管中，利用2D Clean－up Kit 純化蛋白，利用2D－Quant Kit 進(jìn)行蛋白定量。

1.3 熒光標(biāo)記

蛋白樣品分別使用3 種熒光染料Cy3、Cy5 和Cy2進(jìn)行標(biāo)記，按照CyDye DIGE Fluor minimal labeling Kit使用說明進(jìn)行操作:分別取50 μg A 組、B 組、C 組和內(nèi)標(biāo)樣品(內(nèi)標(biāo)樣品為所有樣品的等量混合物，見表1)，加入1 μL 染料工作液，避光、置于冰上30 min，加入1 μL 10 mmol/L 賴氨酸進(jìn)行淬滅標(biāo)記反應(yīng)，避光、置冰上10 min。熒光標(biāo)記后的樣品在－80 ℃條件下保存。

表1 2D－DIGE 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4 雙向電泳和圖像掃描

將用Cy2、Cy3 和Cy5 標(biāo)記的樣品混合后，加入等體積的2 ×sample buffer(2 mol/L Thiourea，7 mol/L Urea，2% pH 值為3 ～10 PharmalyteTMfor IEF，2%DTT，4% CHAPS)，避光、冰上放置10 min。加入水化液(8M Urea，2% CHAPS，0.5% pH 值為3 ～11 PharmalyteTMfor IEF，0.002%溴酚藍(lán)，1% DTT)至450 μL，混勻。將上述溶液加入Holder 中，小心置入pH 值為3 ～11、24 cm 膠條，上面覆蓋一層覆蓋油。IPG phor 設(shè)置參數(shù)如下:30 V、12 h;100 V、1 h;1 000 V、1 h;梯度升至8 000 V、2 h;8 000 V、2 h;500 V、終止。等點(diǎn)聚焦結(jié)束后的膠條先加入10 mL含1% DTT 的SDS 平衡液平衡15 min，再用10 mL含2.5%碘乙酰胺的SDS 平衡液平衡15 min，平衡后置于濃度為12.5%的SDS－PAGE 凝膠上方，再用含有少量溴酚藍(lán)的瓊脂糖溶液封膠，放入EttanTM垂直板電泳儀中電泳。電泳條件:每膠條3 W，45 min;每膠條17 W，至溴酚藍(lán)到達(dá)凝膠底部時停止電泳。用Typhoon9400 熒光掃描儀掃描分析膠，所得圖像用DeCyder 凝膠分析軟件進(jìn)行分析。

1.5 膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜鑒定

制備膠用考馬斯亮藍(lán)染色，將制備膠和分析膠進(jìn)行匹配，挖取差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)酶解后，采用4800 MALDI－TOF/TOF 型號質(zhì)譜儀進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，應(yīng)用MASCOT 軟件對獲得的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行搜索，搜索數(shù)據(jù)庫為Swiss Prot 或NCBInr 數(shù)據(jù)庫。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光掃描

CyDyes 染料標(biāo)記芽變毛白楊誘導(dǎo)生根組(A組)、芽變毛白楊抑制生根組(B 組)和野生型毛白楊誘導(dǎo)生根組(C 組)的插穗蛋白，分別用不同波長的激光對Cy2(488 nm)、Cy3(532 nm)、Cy5(633 nm)進(jìn)行掃描，熒光圖譜如圖1所示。熒光圖譜顯示蛋白點(diǎn)獨(dú)立清晰，質(zhì)量較高。大部分蛋白點(diǎn)分布在分子質(zhì)量20 ～110 ku、pH 值為4 ～10。

圖1 雙向差異凝膠電泳圖譜

2.2 差異蛋白

采用DeCyder 軟件的DIA 模塊對芽變毛白楊抑制生根組(B 組)和誘導(dǎo)生根組(A 組)，以及野生型毛白楊誘導(dǎo)生根組(C 組)和芽變毛白楊誘導(dǎo)生根組(A 組)進(jìn)行膠內(nèi)差異分析，在Gel 18593 中檢測到2368 個蛋白點(diǎn)，在Gel 18595 中檢測到1845 個蛋白點(diǎn)。通過背景消除、斑點(diǎn)檢測、膠內(nèi)匹配，分別以Cy5 標(biāo)記的芽變毛白楊抑制生根組(B 組)和野生型毛白楊誘導(dǎo)生根組(C 組)作為Master 膠，計(jì)算膠中每個蛋白質(zhì)點(diǎn)的相對表達(dá)量，共篩選出具有生物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t 檢驗(yàn)P ＜0.05 和相對表達(dá)量＞1.5 倍)的差異蛋白點(diǎn)14 個(如圖2)。由圖2可知，對比芽變毛白楊抑制生根組(B 組)和誘導(dǎo)生根組(A 組)，篩選出5 個差異蛋白點(diǎn)，其中2 個為下調(diào)蛋白，3 個為上調(diào)蛋白。而對比野生型毛白楊誘導(dǎo)生根組(C組)和芽變毛白楊誘導(dǎo)生根組(A 組)，篩選出10 個差異蛋白點(diǎn)，其中2 個為下調(diào)蛋白，8 個為上調(diào)蛋白(如圖3)。

圖2 差異蛋白表達(dá)圖譜

圖3 部分差異蛋白點(diǎn)的三維圖譜

2.3 質(zhì)譜鑒定

從制備膠上挖取14 個差異蛋白點(diǎn)，經(jīng)膠內(nèi)酶解和質(zhì)譜鑒定，獲得了14 張肽質(zhì)量指紋圖譜(如圖4蛋白點(diǎn)3 的肽質(zhì)量指紋圖譜)，通過MASCOT 搜索引擎檢索14 個差異蛋白點(diǎn)，獲得質(zhì)譜檢測報(bào)告(如表2蛋白點(diǎn)3 的質(zhì)譜檢測報(bào)告)。在NCBI 數(shù)據(jù)庫上搜索上述蛋白的名稱和功能，蛋白點(diǎn)2 是樹皮貯藏蛋白，蛋白點(diǎn)3 是葉綠素a/b 結(jié)合蛋白，蛋白點(diǎn)9是60S 酸性核糖體蛋白P2(如表3和表4)。

3 結(jié)論與討論

插穗不定根的發(fā)生與許多內(nèi)外因素有關(guān)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以找到與不定根發(fā)生相關(guān)的蛋白質(zhì)［9］，進(jìn)而分析蛋白質(zhì)在不定根形成過程中的作用機(jī)制。比較芽變毛白楊抑制生根和誘導(dǎo)生根過程中的差異蛋白，以及毛白楊(野生型)和芽變毛白楊(突變體)誘導(dǎo)生根過程中的差異蛋白，認(rèn)為芽變毛白楊插穗不定根的發(fā)生可能與如下幾類蛋白有關(guān)。

表2 蛋白點(diǎn)3 的質(zhì)譜報(bào)告結(jié)果

圖4 蛋白點(diǎn)3 的肽質(zhì)量指紋圖譜

表3 芽變毛白楊抑制生根組(B 組)和誘導(dǎo)生根組(A 組)對比后的差異蛋白

表4 野生型毛白楊誘導(dǎo)生根組(C 組)和芽變毛白楊誘導(dǎo)生根組(A 組)對比后的差異蛋白

樹皮貯藏蛋白，Sauter 等［10］發(fā)現(xiàn)在楊樹的韌皮部薄壁組織和木射線中一種樹皮貯藏蛋白(Bark Storage Protein ，BSP)，是落葉樹中與種子儲藏蛋白類似的氮素儲藏蛋白質(zhì)。蔣浩等［11］認(rèn)為，葉中蛋白分解為氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到樹皮中合成貯藏蛋白，再分解成氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)到新芽中。扦插生根需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)，主要利用貯藏在插穗中碳氮化合物，插穗生根與碳氮化合物的比率w(C)∶ w(N)有關(guān)，一般的木本嫩枝扦插，w(C)∶ w(N)比越高，生根率越高。在芽變毛白楊生根過程中，樹皮貯藏蛋白持續(xù)下調(diào)表達(dá)，增大了碳氮化合物的比率，提高了生根率。

葉綠素a/b 結(jié)合蛋白，與色素結(jié)合形成色素蛋白復(fù)合體，能迅速將光能傳遞到光系統(tǒng)I 和II 的反應(yīng)中心，引起光化學(xué)反應(yīng)，是光合系統(tǒng)中重要的功能蛋白［12］。葉綠素a/b 結(jié)合蛋白持續(xù)上調(diào)表達(dá)，推測它的表達(dá)與不定根的分化形成有著密切關(guān)系，光合作用可能影響芽變毛白楊插穗不定根的發(fā)生和形成，有進(jìn)一步研究的價值。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋白點(diǎn)6 是與轉(zhuǎn)錄因子HY－5 相近的蛋白質(zhì)。在HY－5 突變體幼苗中，形成的側(cè)生根數(shù)目明顯增多，并且形成速度較快，表明在HY－5 突變體幼苗中生長素的合成量不斷增加［13－14］。HY－5 是隱花色素和細(xì)胞分裂素信號傳遞途徑的集中點(diǎn)［15］，能結(jié)合生長素途徑、乙烯途徑和赤霉素途徑的很多靶基因［16］。轉(zhuǎn)錄因子HY－5 同源蛋白顯著上調(diào)表達(dá)，說明激素信號傳遞可能影響芽變毛白楊插穗不定根的發(fā)生。此外，鑒定出蛋白點(diǎn)1 與WD－ repeat 蛋白相近。WD－repeat 蛋白不僅參與信號傳導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞增殖等過程，而且在分生組織形成、幼苗發(fā)育、光信號傳遞和感知等方面具有重要的作用［17－18］。

60S 酸性核糖體蛋白P2，亦稱為酸性核糖體蛋白［19］，與酸性核糖體磷酸化蛋白P0、P1 共同組成一個獨(dú)特的向外側(cè)凸出的五聚體復(fù)合物核糖體莖區(qū)，與核糖體28SrRNA 的一個保守結(jié)構(gòu)域共同形成一個GTPase 相關(guān)位點(diǎn)，并在蛋白質(zhì)翻譯延伸過程中起重要的作用［20］。本試驗(yàn)中60S 酸性核糖體蛋白P2顯著上調(diào)表達(dá)，該蛋白可能參與或影響某些生根相關(guān)蛋白的合成。

在試驗(yàn)過程中還鑒定出很多未知功能的蛋白，通過相關(guān)蛋白數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)這些蛋白與大麥、擬南芥、毛果楊和云杉等有關(guān)，但是這些蛋白如何在芽變毛白楊生根過程中發(fā)揮作用，目前還尚不清楚，因此對這些蛋白的研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識芽變毛白楊插穗不定根發(fā)生的機(jī)理。

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