魏長(zhǎng)峰，李平原，宋玉平，姜小平

（齊魯制藥有限公司，山東濟(jì)南250100）

UPLC法測(cè)定氨芐西林有關(guān)物質(zhì)

魏長(zhǎng)峰，李平原，宋玉平，姜小平

（齊魯制藥有限公司，山東濟(jì)南250100）

目的建立超高效液相色譜檢測(cè)氨芐西林有關(guān)物質(zhì)的方法。方法采用Acquity UPLC HSSC18色譜柱，以含有冰醋酸、磷酸二氫鉀水溶液和乙腈的不同比例的混合液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為0.5 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為5μL。結(jié)果氨芐西林在0.272 1～32.652μg·mL－1范圍內(nèi)r≥0.999 9；該方法專屬性，重復(fù)性，耐用性，溶液穩(wěn)定性良好。各組分間相互無(wú)干擾，與HPLC具有同等的檢測(cè)能力。結(jié)論該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，效率較高，可作為氨芐西林有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)有效方法。

氨芐西林；超高效液相色譜；有關(guān)物質(zhì)

氨芐西林為藥典［1］收載的廣譜半合成青霉素，應(yīng)用范圍較廣，有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法為HPLC法，收錄于《中國(guó)藥典》2010年版，其檢測(cè)方法存在平衡時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)效率偏低的缺點(diǎn)。超高效液相色譜法［2，3］（UPLC）為近幾年推出并逐漸推廣使用的一種方法，較常規(guī)的液相色譜法（HPLC）具有高速、高分離度和高靈敏度的特點(diǎn)?；赨PLC的優(yōu)點(diǎn)，本文對(duì)氨芐西林有關(guān)物質(zhì)在UPLC的測(cè)試進(jìn)行摸索，以提高工作效率，降低實(shí)驗(yàn)成本［4，5］。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC色譜系統(tǒng)，Empower工作站，Waters 2695色譜系統(tǒng)。

1.2 試劑 氨芐西林對(duì)照品（EP－4.0）；頭孢拉定對(duì)照品（批號(hào)：130427－200306）；供試品（市售，批號(hào)：10817055、10817056、10817057）；乙腈（分析純，Merck公司，批號(hào)：I599130130）；磷酸二氫鉀（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20110913）；冰醋酸（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：101127）；蒸餾水（自制）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超高效液相色譜條件 超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC；檢測(cè)器：TUV檢測(cè)器；波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35℃；色譜柱：Waters HSS T3 C18柱（2.1 mm×50 mm，1.8μm）；流速：0.5 mL·min－1；流動(dòng)相A：取0.5 mL冰醋酸、50 mL 0.2 mol·L－1磷酸二氫鉀和50 mL乙腈混合后，用水稀釋至1 000 mL；流動(dòng)相B：取0.5mL冰醋酸、50mL 0.2mol·L－1磷酸二氫鉀和400 mL乙腈混合后，用水稀釋至1 000 mL，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序表

2.2 高效液相色譜條件 參照《中國(guó)藥典》2010年版（二部）［1］。

2.3 溶液的制備 有關(guān)物質(zhì)分辨液：取頭孢拉定對(duì)照品約2.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取此溶液5 mL和5mL有關(guān)物度對(duì)照品溶液混合，作為分辨液。

有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品溶液：取無(wú)水氨芐西林對(duì)照品約27.0 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取5 mL，置100 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A稀釋至刻度，搖勻，作為有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品溶液。

有關(guān)物質(zhì)供試品溶液（臨用現(xiàn)配）：取氨芐西林供試品約31.0 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)結(jié)果 分別采用UPLC和HPLC對(duì)氨芐西林系統(tǒng)適用性溶液進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，氨芐西林峰與頭孢拉定峰均能很好的分離，分離度均大于3.0，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 氨芐西林系統(tǒng)適用性溶液UPLC圖譜與HPLC圖譜

3.2 系統(tǒng)精密度試驗(yàn)結(jié)果 取有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品溶液，按上述色譜條件試驗(yàn)，重復(fù)進(jìn)樣6次，氨芐西林保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.4和0.1%。

3.3 專屬性試驗(yàn)結(jié)果 取一定量的氨芐西林分別進(jìn)行酸、堿、氧化、高溫、光照破壞實(shí)驗(yàn)，同時(shí)取氨芐西林各起始物料、氨芐西林粗品按照上述色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明各起始物料峰與氨芐西林峰均能有效分離，破壞降解后各雜質(zhì)峰均能與主峰有效分離，不會(huì)干擾樣品的檢測(cè)。

3.4 檢測(cè)限 取稀釋劑作為空白溶液按上述條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算儀器的基線平均噪聲。

稱取無(wú)水氨芐西林對(duì)照品27.21 mg，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相A溶解并稀釋至刻度，搖勻。用流動(dòng)相A逐步稀釋至氨芐西林峰的峰高為基線噪聲的3倍作為檢測(cè)限溶液，計(jì)算出氨芐西林的檢測(cè)限為0.068μg·mL－1。

3.5 定量限 根據(jù)檢測(cè)限項(xiàng)下的計(jì)算的結(jié)果對(duì)氨芐西林對(duì)照品溶液進(jìn)行定量稀釋，按上述色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖，是氨芐西林峰的峰高為基線噪聲的10～15倍，計(jì)算定量限為0.272 1μg·mL－1。

3.6 線性范圍 在預(yù)先設(shè)定的LOQ～雜質(zhì)限度的120%濃度范圍內(nèi)，分別配制LOQ、限度40%、限度80%、限度點(diǎn)、限度的120%5個(gè)濃度的溶液。按上述色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)濃度作曲線，計(jì)算回歸方程與回歸系數(shù)。線性回歸方程為：Y＝571.983 8X－16.829 7，r＝0.999 99。

3.7 重復(fù)性 氨芐西林（批號(hào)：10817057），稱取6份，按上述色譜條件分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)。單個(gè)雜質(zhì)6次的平均值為0.20%，RSD＝0%；總雜質(zhì)6次的平均值為0.50%，RSD＝2.0%。

3.8 穩(wěn)定性 取氨芐西林（批號(hào)：10817057）供試品一份，分別在0、1、2、4、6、8、10 h進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，隨著放置時(shí)間的延長(zhǎng)，總雜質(zhì)在逐漸增大，建議該樣品應(yīng)臨用新制，在8 h內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 供試品穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

3.9 耐用性 取專屬性項(xiàng)下各溶液，配制混合溶液，針對(duì)以上色譜條件，在其他條件不變的情況下，分別將流速改變±0.1 mL·min－1，柱溫改變±5℃，梯度比例改變±3%，更換同類型的其他色譜柱，對(duì)混合溶液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，改變以上比例，氨芐西林峰與相鄰雜質(zhì)峰均能達(dá)到有效分離。

4 樣品檢測(cè)

取氨芐西林樣品3批，分別按照上述色譜條件和《中國(guó)藥典》2010年版色譜條件進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，計(jì)算雜質(zhì)含量，結(jié)果如表3。

Determ ination of related substances of ampicillin by UPLC

WEIChang-feng，LIPing-yuan，SONG Yu-ping，JIANG Xiao-ping
（Qilu Pharmaceutical Co.，Ltd.，Jinan 250100，China）

ObjectiveTo develop a UPLCmethod for the determination of related substances of ampicillin.MethodsA gradientmethod using an Acquity UPLC HSSC18column and detection at 254 nm was developed，takingmixture of acetic acid and potassium dihydrogen phosphate solution and acetonitrile as mobile phase，at the flow rate of 0.5 mL· min－1.Column temperaturewas35℃，and injection volumewas5μL.ResultsThe linear ranges of ampicillin was0.272 1～32.652μg·mL－1（r≥0.999 9）.Thismethod had fine specificity，repeatability，robustness.And the solution was stable.There was no interference between the components.This method had the same detectability with HPLC method.ConclusionThismethod had good specificity，sensitivity，and efficiency.It can be used to detect related substances of ampicillin.

Ampicillin；UPLC；Related substances

R927.1

：A

2095－5375（2014）03－0148－003

魏長(zhǎng)峰，男，研究方向：藥物分析，E－mail：changfeng.wei＠qilu－pharna.com