林曉彰, 劉必謙, 周湘池, 章思思, 莊 怡

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

蝦蟹殼氨基葡萄糖-半胱氨酸美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

林曉彰, 劉必謙, 周湘池, 章思思, 莊 怡

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院 應(yīng)用海洋生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 浙江 寧波 315211)

為了探討半胱氨酸-氨糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物(GCMRPs)對(duì)酪氨酸酶催化活性的影響及其在對(duì)蝦冷藏保鮮中的作用, 以半胱氨酸及蝦蟹殼氨基葡萄糖鹽酸鹽為原料, 在堿性條件下(pH=10)制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物, 并分別測(cè)定其酪氨酸酶二酚酶活抑制能力及對(duì)南美白對(duì)蝦黑變腐敗的影響。結(jié)果顯示, GCMRPs具有很強(qiáng)的二酚酶活抑制能力, 對(duì)酪氨酸酶二酚酶活的抑制類型為不可逆的競(jìng)爭(zhēng)性抑制。通過比較, 在同濃度下, 其抑制酪氨酸酶二酚酶活能力比半胱氨酸、曲酸更為優(yōu)越, 可做為一種有效的酶抑制劑。同時(shí), 鮮蝦保鮮實(shí)驗(yàn)顯示該產(chǎn)物有很好的防止黑變的能力, 且有一定的防腐能力。

酪氨酸酶; 半胱氨酸; 氨糖; 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物; 抑制; 黑變

酪氨酸酶是一種含銅氧化酶, 是催化人體黑色素生成的重要酶類, 同時(shí)也是蔬菜水果及蝦蟹類產(chǎn)品在儲(chǔ)藏過程中產(chǎn)生褐變黑變現(xiàn)象的主要酶類[1]。酪氨酸酶主要存在于人體的黑色素細(xì)胞中, 機(jī)體受外界刺激(紫外)或自身產(chǎn)生的過激反應(yīng), 均會(huì)造成酪氨酸酶的活性被大量激活, 使人體皮膚產(chǎn)生黑色素沉著現(xiàn)象, 形成雀斑、黃褐斑、老年斑等普遍的皮膚問題, 影響面容美觀, 給人們?cè)斐梢欢ǖ男睦韷毫Χg接影響其生活質(zhì)量[2]。同時(shí), 酪氨酸酶影響農(nóng)作物以及蝦蟹類色澤, 從而降低其營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3-4]。因此, 酪氨酸酶抑制劑的研發(fā)對(duì)農(nóng)業(yè)及祛斑產(chǎn)品行業(yè)具有重要意義。

目前, 已有大量的酪氨酸酶抑制劑被用作化妝品美白成分的報(bào)道, 如氫醌、熊果苷、曲酸、甘草黃酮等[5-6]。但這些市場(chǎng)上常見的酪氨酸酶抑制劑不穩(wěn)定, 易氧化, 光敏性強(qiáng), 且部分抑制劑有致癌的潛在危險(xiǎn)[7-9], 因此, 開發(fā)安全穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑十分必要。美拉德反應(yīng)是由還原性糖類(羰基)物質(zhì)與帶游離氨基物質(zhì)(蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸)發(fā)生的一種非酶褐變反應(yīng), 在食品加工過程中能形成種類繁多的風(fēng)味物質(zhì)[10], 且其在反應(yīng)過程中產(chǎn)生大量還原性酮類物質(zhì), 具有一定的金屬螯合能力[11-12], 可做為酪氨酸酶抑制劑篩選的重要研究對(duì)象。本研究以氨基葡萄糖和半胱氨酸兩種安全無毒的原料制備美拉德反應(yīng)產(chǎn)物, 并對(duì)其酪氨酸酶抑制活性及抗黑作用進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氨基葡萄糖鹽酸鹽購自浙江金殼海洋生物化學(xué)有限公司; 酪氨酸酶購自美國 Worthington公司; L-DOPA購自sigma公司; 曲酸、半胱氨酸、硼酸等試劑均為分析純; 保鮮實(shí)驗(yàn)的南美白對(duì)蝦購自寧波歐尚超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 GCMRPs的制備

GCMRPs的制備方法參考文獻(xiàn)[13], 并略作修改。精確稱取一定量等摩爾半胱氨酸及氨基葡糖鹽酸鹽, 溶于 0.1mol/L硼酸鹽緩沖液(pH=10.0)中, 使其濃度為20 mmol/L, 105℃油浴加熱8 h。待反應(yīng)完全后, 溶液呈黃色, 立即冰水浴冷卻, 4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GCMRPs二酚酶活抑制能力測(cè)定

酪氨酸酶二酚酶活抑制能力測(cè)定參考文獻(xiàn)[14],并略作修改。以GCMRPs延緩L-DOPA生成紅色物質(zhì)多巴醌的速率大小來測(cè)定二酚酶活抑制作用, 其中多巴醌在 475nm 有最大吸收峰。取不同體積GCMRPs樣液于0.6 mL 5mmol/L L-DOPA溶液中,并以 0.25mol/L磷酸鉀緩沖液(pH=6.5)補(bǔ)至 2.8 mL, 30℃水浴10 min。加入30℃預(yù)熱的200 μL 250 U/mL酪氨酸酶后, 立即混勻記錄 10 min內(nèi)A475的變化(ΔA475), 每30 s記錄1次。以同濃度氨基葡萄糖-半胱氨酸未加熱混合物(Unheated Mix)、以及曲酸(KA)做參照, 以不加樣品為空白對(duì)照, 記 1 min內(nèi)樣品ΔA475為Aj, L-DOPA自氧化 ΔA475為Ai, 空白對(duì)照ΔA475為A0, 計(jì)算相對(duì)酶活率, 其公式如下:

1.2.3 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制類型測(cè)定

在測(cè)酶活體系中, 固定底物濃度, 改變酶添加量, 測(cè)定不同GCMRPs添加量對(duì)酶催化速率的影響,以酶活為橫坐標(biāo), 催化速率為縱坐標(biāo), 建立曲線, 分析GCMRPs抑制劑類型。

在測(cè)酶活體系中, 固定酶活為 50U, 改變底物L(fēng)-DOPA的濃度c, 測(cè)定不同濃度GCMRPs添加量對(duì)酶催化速率v的影響, 以1/c為橫坐標(biāo), 1/v為縱坐標(biāo), 建立Lineweaver-Burk 曲線, 分析GCMRPs的抑酶機(jī)制。

1.2.4 GCMRPs對(duì)鮮蝦冷藏過程中黑變的影響

以南美白對(duì)蝦為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 通過觀察產(chǎn)物蝦體黑變情況評(píng)估GCMRPs抗黑變能力。清水洗凈南美白對(duì)蝦后, 瀝干后, 以蝦液比 1∶2(W/V)浸于 20 mmol/L GCMRPs溶液中10 min, 取出瀝干后, 裝盤, 以保鮮膜封好, 4℃冰箱冷藏。以不處理的南美白對(duì)蝦為對(duì)照組, 以含同濃度半胱氨酸、氨基葡糖鹽酸鹽溶液為陽性參照。每隔3 d觀察一次鮮蝦蝦體黑變情況, 每次進(jìn)行黑變感官評(píng)分, 共計(jì) 12 d, 每次進(jìn)行黑變感官評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考Phonpala等[15]人的方法并略作修改, 評(píng)估方法如下: 0=未黑變; 2=20%頭胸甲黑變; 4=40%頭胸甲黑變; 6=60%頭胸甲黑變; 8=80%頭胸甲黑變并有輕微足黑變; 10=頭胸甲完全黑變, 且軀干足有明顯黑變。

1.2.5 揮發(fā)性鹽基總氮(T-VBN)測(cè)定

TVB-N 的測(cè)定采用GB/T 5009.44-2003 中 4.1的方法。

1.2.6 細(xì)菌總數(shù)(TVC)測(cè)定

細(xì)菌總數(shù)測(cè)定參考 GB/T 4789.2003, 菌落總數(shù)測(cè)定法。

1.2.7 二氧化硫含量測(cè)定

亞硫酸鹽測(cè)定參考GB/T 5009.34-2003《食品中亞硫酸鹽的測(cè)定》中蒸餾法。

2 結(jié)果

2.1 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶二酚酶活抑制作用

從圖1可以看出, GCMRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制作用為濃度依賴型, 即隨著其 GCMRPs濃度增加, 酪氨酸酶二酚酶相對(duì)酶活逐漸降低, 而相應(yīng)的酶促反應(yīng)延滯時(shí)間有顯著的增長。當(dāng)GCMRPs添加量7.5μL時(shí), 酶活降低99.46%, 延滯時(shí)間達(dá)到132 s, 而參照物同濃度Unheated Mix酶活降低率只有68%, 延滯時(shí)間28 s, 說明GCMRPs中存在酪氨酸酶強(qiáng)抑制劑,其抑制效率遠(yuǎn)比Unheated Mix高。

圖1 不同濃度GCMRPs對(duì)二酚酶活及延滯時(shí)間的影響Fig.1 Effect of GCMRPs on relative activity and lag time of tyrosinase

以1 mmol/L L-DOPA為底物, 比較GCMRPs與同濃度曲酸以及半胱氨酸對(duì)酪氨酸酶二酚酶活抑制能力, 結(jié)果如圖2所示。15 μL GCMRPs在10 min內(nèi)能基本完全抑制住酶促反應(yīng), 其10 min內(nèi)的ΔA475為0.003, 而相應(yīng)的Unheated Mix及KA 10 min內(nèi)的吸光值變化分別為0.248, 0.163?？梢奊CMRPs的抑酶能力更強(qiáng)。

圖2 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶二酚酶活的抑制曲線Fig.2 Progress curves for inhibition of tyrosinase by GCMRPs

2.2 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制機(jī)理

固定酶量, 改變底物濃度, 研究不同 GCMRPs添加量對(duì)酶活的作用, 如圖 3所示, 其中檢測(cè)用GCMRPs添加量分別為1.5、3.0、4.5 μL。從圖3可知, 經(jīng)雙倒數(shù)法獲得的直線相交于縱坐標(biāo)同一點(diǎn),且隨著 GCMRPs濃度不斷增大, 截距逐漸減小,Km逐漸變大, 說明GCMRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖 3 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶抑制作用的 Lineweaver-Burk曲線Fig 3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of mushroom tyrosinase by GCMRPs

圖4反映了酪氨酸酶經(jīng)GCMRPs處理后, 其有效酶活催化速率與酶量的關(guān)系, 以有效酶活催化速率對(duì)酶量作圖得到一組斜率為0.0033的相互平行的直線, 說明 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制作用是不可逆的, 這說明 GCMRPs可能是減少有效酶量來抑制催化反應(yīng)的。

圖4 GCMRPs對(duì)酪氨酸酶二酚酶活的抑制機(jī)理曲線Fig 4 Curve for inhibition mechanism of diphenolase activity of mushroom tyrosinase by GCMRPs

2.3 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦的冷藏效果的影響

以20 mmol/L GCMRPs浸泡南美白對(duì)蝦, 4℃冷藏, 研究GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦黑變的影響(圖5)。從圖5可知, GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦的黑變有很好的抑制作用, 對(duì)照組未作處理的南美白對(duì)蝦在9 d后基本完全黑變, 而GCMRPs只有少許黑變, 在保藏12 d后, 其黑變指數(shù)為2.33。此外, 以同濃度為Unheated Mix處理的鮮蝦, 在前3 d有一定的抑制作用, 但其后黑變程度明顯上升。經(jīng)GCMRPs處理的鮮蝦蝦體黑變?cè)鲩L緩慢, 與該產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用相一致。

圖5 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦黑變得分的影響Fig.5 Effect of GCMRPs on melanosis score of Pacific white shrimp

2.4 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦冰藏過程中T-VBN的影響

經(jīng)不同方式處理的南美白對(duì)蝦在冷藏過程中T-VBN的變化見圖6。經(jīng)GCMRPs處理能有效減小南美白對(duì)蝦蝦體T-VBN量, 且在12 d內(nèi)保持鮮蝦不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少許腐敗胺類氣味, 第 9 天 T-VBN含量為 35.8 mg/100 g, 略超食品安全規(guī)定范圍(30 mg/100 g)。Unheated Mix處理的鮮蝦在一定程度上抑制了 T-VBN 的生成, 但其抑制能力小于GCMRPs。同時(shí), 未經(jīng)任何處理的鮮蝦, 其T-VBN量隨著冷藏時(shí)間的推移, T-VBN出現(xiàn)大幅度增長, 第6天后T-VBN達(dá)47.1 mg/100 g遠(yuǎn)超食品安全規(guī)定范圍,腐敗氣味明顯, 第12天后, 肉質(zhì)糜爛, 具惡臭。

圖6 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦冰藏過程中T-VBN變化的影響Fig.6 Effect of GCMRPs on T-VBN of Pacific white shrimp

2.5 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦冰藏過程中TVC的影響

圖7為南美白對(duì)蝦在4℃冷藏過程中的細(xì)菌總數(shù)變化。蝦體自身帶有大量的細(xì)菌, 其細(xì)菌含量log值達(dá) 4.25, 在冷藏過程中, 蝦體細(xì)菌總數(shù)都出現(xiàn)增長趨勢(shì)。其中未處理組第3天后, 細(xì)菌總數(shù)就有明顯增加, 其log值增至5.114; GCMRPs組細(xì)菌增殖不明顯,并以一個(gè)較平緩的增長趨勢(shì)增加, 但在第 9天有一個(gè)較為明顯的增長幅度。同時(shí), 在整個(gè)冷藏過程中, GCMRPs組的細(xì)菌總數(shù)均比Unheated Mix組低。

3 討論

3.1 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可作為酪氨酸酶抑制劑研究對(duì)象

酪氨酸酶是一種氧化酶類, 其活性位點(diǎn)含兩個(gè)銅離子, 因此國內(nèi)外學(xué)者指出酪氨酸酶的抑制機(jī)理可能與抑制劑的抗氧化性、金屬螯合能力有關(guān)。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有一定的還原能力、清除自由基能力以及金屬螯合能力[12,16], 同時(shí)被廣泛運(yùn)用于食品添加劑中, 且已有報(bào)道美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中具有促進(jìn)人體健康的物質(zhì)[17], 因此可做為研究酪氨酸酶抑制劑的重要研究對(duì)象。

圖7 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦冰藏過程中TVC變化的影響Fig.7 Effect of GCMRPs on TVC of Pacific white shrimp

3.2 GCMRPs可有效抑制酪氨酸酶, 其抑制類型為不可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制

目前, 關(guān)于半胱氨酸-還原性糖的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對(duì)酪氨酸酶的抑制作用也有報(bào)道。研究顯示, 以葡萄糖-半胱氨酸反應(yīng)模式所得MRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制效率沒有未加熱的混合物高[18], 但本文 GCMRPs不僅對(duì)酪氨酸酶具有顯著的抑制作用, 且其反應(yīng)產(chǎn)物比Unheated Mix的抑制效率更高, 其延滯時(shí)間約為Unheated Mix的5倍, 推測(cè)該反應(yīng)體系中氨基葡糖鹽酸鹽一個(gè)額外的氨基基團(tuán)的引入是造成GCMRPs抑酶特性反差的原因之一。

目前, 酪氨酸酶抑制劑研究領(lǐng)域日益廣泛, 許多常見酪氨酸酶抑制劑, 如曲酸、半胱氨酸也已被用于保鮮與化妝品行業(yè)。但評(píng)價(jià)酪氨酸酶抑制效率的強(qiáng)弱常因?qū)嶒?yàn)方法不同而難以比較。因此, 常以同濃度下曲酸的抑酶效率做為陽性參照。在同濃度條件下, GCMRPs對(duì)酪氨酸酶的抑制作用比曲酸更加優(yōu)越, 預(yù)示了其在抑黑方面的應(yīng)用前景。

3.3 GCMRPs對(duì)南美白對(duì)蝦具有良好的抑黑變效果

蝦體黑變主要是由蝦體中的酪氨酸酶和微生物共同作用引起的[19]。因此, 酪氨酸酶抑制劑及抑菌劑在一定程度上能抑制蝦體的黑變過程。報(bào)道指出美拉德產(chǎn)物不僅對(duì)酪氨酸酶具有抑制作用, 且具有一定的抑菌作用[20-21]。而實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, GCMRPs不僅可有效抑制對(duì)蝦的黑變, 且可有效抑制蝦體中細(xì)菌的增殖, 具有一定的防腐效果。雖然 GCMRPs中成分還有待進(jìn)一步確定, 但有報(bào)道含硫化合物形成的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中存在噻吩、噻唑類等抑菌物質(zhì)[22],因此GCMRPs的防腐作用可能與這類物質(zhì)相關(guān)。

目前, 我國主要以焦亞硫酸鈉作為鮮蝦保鮮劑,該成分價(jià)格低廉, 且抑黑效果不錯(cuò), 因此受到蝦蟹類生產(chǎn)者的青睞。但焦亞硫酸鈉容易造成二氧化硫殘留問題, 不僅破壞蝦體營養(yǎng)成分, 同時(shí)危害人體健康, 因此應(yīng)盡量避免使用。卓華龍等[23]以3%焦亞硫酸鈉浸泡處理海捕蝦, -5～-2℃條件下冷藏, 能維持蝦體色澤 6 d, 但其二氧化硫殘留量高達(dá)148.74 mg/100 g(標(biāo)準(zhǔn)要求≤100 mg/100 g)。本實(shí)驗(yàn)GCMRPs在較低濃度即能有效抑制9 d, 且其二氧化硫殘留量僅為5.38 mg/100 g, 不存在二氧化硫殘留超標(biāo)問題。有部分學(xué)者通過GC-MS分析了多種以半胱氨酸為原料的美拉德產(chǎn)物產(chǎn)物中揮發(fā)性氣體成分,發(fā)現(xiàn)所有反應(yīng)模式的產(chǎn)物均不存在二氧化硫[22,24-25],進(jìn)一步說明了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物作為抑黑保鮮劑的安全性。GCMRPs是以氨基葡萄糖和半胱氨酸為原料合成, 二者資源豐富, 其加工技術(shù)也日趨成熟, 價(jià)格也比較低廉, 預(yù)示其在保鮮劑上有良好的應(yīng)用前景。

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(本文編輯: 康亦兼)

Inhibitory effect of glucosamine-cysteine maillard reaction product on tyrosinase

LIN Xiao-zhang, LIU Bi-qian, ZHOU Xiang-chi, ZHANG Si-si, ZHUANG Yi,
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology of Ministry of Education, School of Marine Science, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Mar., 19, 2013

tyrosinase; cysteine; glucosamine; Maillard reaction product; inhibit; melonosis

Research on tyrosinase inhibitors has become a common concern due to the important role of tyrosinase both in mammalian melanogenesis and fruit or shrimp enzymatic browning. In this paper, Maillard reaction products prepared by heating glucosamine hydrochloride-cysteine model in alkaline condition (GCMRPs) were studied for their tyrosinase inhibition activity and effect on quality of shrimp during ice-storage. The results showed that, this compound was an irreversible competitive inhibitor exhibiting a higher inhibitory effect than cysteine and kojic acid at the same concentration. In addition, the effect of GCMRPs on quality of pacific white shrimp during ice-storage was investigated. Shrimp treated with 20 mmol/L GCMRPs exhibited lower melanosis score and total viable count compared with those without treatment throughout the storage period.

Q554

A

1000-3096(2014)03-0014-06

10.11759/hykx20130319002

2013-03-19;

2013-06-25

寧波市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2006B100069)

林曉彰(1989-), 男(漢族), 浙江溫州人, 碩士研究生, 主要研究方向?yàn)樘穷愌苌锢野彼崦敢种苹钚? E-mail: evilforcelin @163.com; 劉必謙, 通信作者, 研究員, E-mail: lbqhy@nbu.edu.cn