趙立儀，李路寧，申芮萌，朱 寧，孫愛東，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

?；{(lán)莓花青素的穩(wěn)定性研究

趙立儀1，2，李路寧1，2，申芮萌1，2，朱 寧1，2，孫愛東1，2，*

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，北京 100083；2.北京林業(yè)大學(xué)林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

采用月桂酰氯作為?；噭┡c自提藍(lán)莓花青素酰化，對酰化后產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，并對不同濃度添加劑、金屬離子以及氧化還原劑對?；笏{(lán)莓花青素穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：酰化后藍(lán)莓花青素對光、熱和強(qiáng)氧化劑穩(wěn)定性顯著提高；VC、苯甲酸鈉、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸鈉等可以提高?；笏{(lán)莓花青素的穩(wěn)定性。K+、Na+、Cu2+以及濃度小于0.05mol/L的Fe2+對其無顯著性影響；Ca2+/Fe3+以及濃度達(dá)到0.1mol/L的Mg2+、Fe2+對其具有破壞作用。

藍(lán)莓花青素，酰基化，穩(wěn)定性

藍(lán)莓（Blueberry）又稱越桔，杜鵑花科越桔屬多年生落葉或常綠灌木，分布于亞寒帶、溫帶及亞熱帶。藍(lán)莓果實(shí)為漿果，果肉細(xì)膩，酸甜適度，既可以鮮食，也可以加工成果汁飲料、果酒飲品等。藍(lán)莓除含常規(guī)的營養(yǎng)成分外，還含有豐富的花青素。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，花青素具有保護(hù)和改善視力，治療心血管疾病，預(yù)防肥胖，防止腦神經(jīng)老化，預(yù)防癌癥等功能[1-2]。藍(lán)莓花青素是水溶性色素，在光照、高溫和氧氣的作用下很容易被降解，成為阻礙其在食品工業(yè)中應(yīng)用的瓶頸。為了改善花青素的穩(wěn)定性，擴(kuò)大此類色素的應(yīng)用領(lǐng)域，人們分別采用加輔色劑、抗氧化劑、螯合劑、微膠囊以及化學(xué)修飾的方法來提高花青素的穩(wěn)定性[3-5]。國內(nèi)外大多采用乙酸等羧酸作為?；瘎?，?；Ч焕硐?，反應(yīng)進(jìn)行較慢。本文采用月桂酰氯作為?；瘎?，將藍(lán)莓花青素?；?，較之前研究反應(yīng)更為徹底迅速。并研究?；{(lán)莓花青素的穩(wěn)定性，這對進(jìn)一步開發(fā)利用藍(lán)莓花青素具有重要意義[6-7]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

野生藍(lán)莓樣品 產(chǎn)于大興安嶺林區(qū)，-80℃冷凍保存；色譜純甲醇 購于Fisher公司；月桂酰氯、甲醇、三氟乙酸、TFA、蒸餾水、蔗糖、葡萄糖、雙氧水、硫酸亞鐵、硫酸鈉、氯化鉀、檸檬酸、檸檬酸鈉 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上化學(xué)試劑 除特殊說明外均為分析純。

水浴鍋 天津?qū)嶒?yàn)電爐有限公司；UV-1200紫外分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；Senco旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申順生物科技有限公司；FA1604N電子分析天平 上海精密儀器廠；JB-5型定時(shí)雙向數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；FD-18真空冷凍干燥機(jī) 北京德天佑科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藍(lán)莓花青素的提取 參考Fossen等[8]方法并加以改進(jìn)。將在-80℃下貯藏的藍(lán)莓鮮果在0℃下解凍24h，然后將其研磨成漿，按照料液比1∶5加入含0.5%三氟乙酸（TFA）的甲醇溶液，在0℃下封口、遮光攪拌提取24h。將提取液置于5000r/min的離心機(jī)中離心15min，收集上清液。取上清液于低于38℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，除去甲醇，得到濃縮液。

1.2.2 藍(lán)莓花青素的純化 將濃縮液用1∶1（V∶V）乙酸乙酯萃洗，反復(fù)振蕩，除去上層脂類物質(zhì)，將此操作反復(fù)3次。將除去脂類的濃縮液通入離子交換樹脂XAD-7柱，用含0.5%TFA的蒸餾水以20倍柱體積沖洗柱子，除去非花青素化合物。然后通入含0.5%TFA的甲醇洗脫柱子，收集洗脫液。將收集的洗脫液于38℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中真空濃縮除去甲醇，得到純化的花青素溶液。

1.2.3 藍(lán)莓花青素的?；?參考李穎暢[9]的方法并加以改進(jìn)，將提純的藍(lán)莓花青素溶液與月桂酰氯以1∶3的比例混合，在90℃下水浴加熱40min，取出后冷卻至室溫，用紫外可見分光光度計(jì)在200~400nm處測定光譜，觀察在290~330nm是否有吸收峰，如果有則說明發(fā)生了?；痆10]。將冷卻后的藍(lán)莓花青素?；芤河胮H=3的檸檬酸-檸檬酸鈉溶液稀釋50倍，用于穩(wěn)定性的測量。

1.2.4 不同條件對酰化藍(lán)莓花青素穩(wěn)定性的影響

1.2.4.1 已?；ㄇ嗨乇４媛实臏y定方法[11-13]分別取稀釋后樣品1mL，加入pH為1.0、4.5的緩沖液9mL，40℃水浴平衡40min后，于304nm和548nm波長下測定吸光度，并按下式進(jìn)行計(jì)算：

花青素含量（mg/L）=（A×MW）/（∑×1）×Df×1000保存率（%）=A2/A1×100

式中，MW為?；蟮氖杠嚲账?3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量；∑-摩爾消光系數(shù)；Df-稀釋因子（樣品總的稀釋倍數(shù)）；A2已處理的酰化花青素吸光值；A1未處理的?；ㄇ嗨匚庵?。

pH1.0的緩沖液：準(zhǔn)確稱取1.49g KCl用蒸餾水定容至1009mL。準(zhǔn)確量取1.7mL鹽酸（分析純）用蒸餾水定容至100mL，配成0.2mol/L鹽酸溶液，將KCl溶液與鹽酸溶液以25∶67的比例混合。用KCl溶液調(diào)pH（1.0±0.1）。

pH4.5的緩沖液：準(zhǔn)確稱取1.64g醋酸鈉用蒸餾水定容至100mL，用鹽酸調(diào)pH（4.5±0.1）。

1.2.4.2 酰化藍(lán)莓花青素的熱穩(wěn)定性 將已稀釋的?；{(lán)莓花青素溶液分別取30mL 3份放入80、100、120℃的水浴鍋中，每隔一定時(shí)間（2、4、6、8、10h）測定其含量變化。

1.2.4.3 ?；{(lán)莓花青素的光穩(wěn)定性 取已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素50mL裝入白色試劑瓶中，在自然光照條件下貯存。每隔2d測定其含量變化。

1.2.4.4 添加劑對?；{(lán)莓花青素的影響 取已稀釋的酰化藍(lán)莓花青素每份30mL分別加入不同濃度的VC、蔗糖、葡萄糖、苯甲酸鈉、檸檬酸，對照組加30mL蒸餾水，室溫靜置2h，測定其含量變化。

1.2.4.5 金屬離子對?；{(lán)莓花青素的影響 取已稀釋的?；{(lán)莓花青素每份30mL，分別加入不同濃度的Na+、K+、Cu2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+在2、4、6、8、10h測定其含量變化。

1.2.4.6 氧化還原劑對?；{(lán)莓花青素的影響 取已稀釋的?；{(lán)莓花青素每份30mL，分別加入不同濃度的亞硫酸鈉、過氧化氫溶液，靜置30min，測定其含量變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 ?；{(lán)莓花青素的紫外吸收光譜

測定?；{(lán)莓花青素在200~400nm的吸收光譜，觀察在290~330nm是否有明顯吸收峰，如果有則說明發(fā)生了酰基化[10]。藍(lán)莓花青素與月桂酰氯發(fā)生?；磻?yīng)后，在紫外光譜中304nm處出現(xiàn)吸收峰，如圖1所示，說明藍(lán)莓花青素已經(jīng)?；?。

圖1 ?；{(lán)莓花青素紫外-可見吸收光譜圖Fig.1 The ultraviolet-visible absorption spectrum of acylated blueberry anthocyanins

圖2 加熱80℃對?；ㄇ嗨睾臀歹；ㄇ嗨氐挠绊懕容^Fig.2 Effect comparison of 80℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

2.2 溫度對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨氐挠绊?/p>

由圖2~圖4可以看出，隨著溫度的升高和加熱時(shí)間的延長，酰化的藍(lán)莓花青素和未?；乃{(lán)莓花青素的保留率都下降。但從圖中可以看出，在80、100、120℃加熱0~2h，?；ㄇ嗨睾臀歹；ㄇ嗨氐谋Ａ袈蕸]有顯著性差距，但當(dāng)加熱時(shí)間大于4h后未被?；乃{(lán)莓花青素下降速率明顯高于?；乃{(lán)莓花青素，說明藍(lán)莓花青素?；竽蜔嵝蕴岣?。在80、100、120℃加熱10h后?；乃{(lán)莓花青素保留率分別為83.24%、74.17%和62.17%，明顯高于未被酰化的藍(lán)莓花青素，說明藍(lán)莓花青素?；鬅岬姆€(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高。

2.3 光照對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨氐挠绊?/p>

圖3 加熱100℃對?；ㄇ嗨睾臀歹；ㄇ嗨氐挠绊懕容^Fig.3 Effect comparison of 100℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

圖4 加熱120℃對?；ㄇ嗨睾臀歹；ㄇ嗨氐挠绊懕容^Fig.4 Effect comparison of 120℃ between the acylated anthocyanins and proanidine

圖5 光照對已?；臀歹；{(lán)莓花青素的影響比較Fig.5 Effect comparison of light between the acylated anthoocyanins and proanidine

由圖5可知，酰化的和未?；乃{(lán)莓花青素隨光照時(shí)間的延長穩(wěn)定性下降，但?；蟮乃{(lán)莓花青素的光穩(wěn)定性顯著高于未?；乃{(lán)莓花青素，光照6d時(shí)，已?；{(lán)莓花青素的保留率在90%以上，而未?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈室呀档?0%以下；光照10d后?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈室廊痪S持在80%以上，而未?；ㄇ嗨乇Ａ袈蕿?4.37%。由此可知，藍(lán)莓花青素?；蟮墓夥€(wěn)定性顯著（p＜0.05）高于未?；ㄇ嗨?，對光的耐受力也增強(qiáng)。

2.4 添加劑對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響

2.4.1 VC對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響 由圖6可知，隨著VC添加量的增加，已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈首兓厔葺^未添加VC的已?；ㄇ嗨爻士傮w升高趨勢。與對照組相比，不同添加量的VC對已酰化花青素的保留率有增強(qiáng)作用，10h后已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈示?0%左右。由方差分析可知，添加不同濃度的VC對已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性影響沒有顯著性的差異（p＞0.05），但已添加VC較未添加VC的已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明適量添加VC可以增加已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性。

圖6 VC對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨氐挠绊慒ig.6 Effect of VCon the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.2 蔗糖對藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響由圖7可知，與對照組相比，隨著蔗糖添加量的增大，已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈士傮w呈逐漸增加趨勢。當(dāng)蔗糖的添加量達(dá)到30%時(shí)，已酰化花青素放置10h后保留率仍為85%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的蔗糖對已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但當(dāng)蔗糖的添加量達(dá)到30%時(shí)，已酰化花青素的穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）高于未添加蔗糖的?；ㄇ嗨?，說明添加適量的蔗糖可以增加已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性。

圖7 蔗糖對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of sucrose on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.3 葡萄糖對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響

由圖8可以看出，與對照組相比，隨著葡萄糖添加量的增大，已?；{(lán)莓花青素的保留率也逐漸增大，當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到30%時(shí)，已?；ㄇ嗨胤胖?0h保留率基本在80%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的葡萄糖對已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但當(dāng)葡萄糖添加量大于10%時(shí)，較未添加葡萄糖的?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明添加適量的葡萄糖同蔗糖一樣都可以增加已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性。

圖8 葡萄糖對藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of glucose on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.4 苯甲酸鈉對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響 由圖9可知，隨著苯甲酸鈉添加量的增加，已酰化花青素的保留率也逐漸增加，苯甲酸鈉的添加量達(dá)到1%時(shí)，已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈试?0%左右。由方差分析知，添加不同濃度的苯甲酸鈉對已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但當(dāng)苯甲酸鈉添加量大于0.25%時(shí)，較未添加苯甲酸鈉的酰化花青素穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明添加適量的苯甲酸鈉對花青素的穩(wěn)定性有一定程度的增強(qiáng)作用。

圖9 苯甲酸鈉對藍(lán)莓中已酰化花青素穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of sodium benzoate on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.4.5 檸檬酸對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響 由圖10可知，在添加不同濃度的檸檬酸0~2h，與對照組相比，已?；幕ㄇ嗨乇Ａ袈视兴陆?，但仍然維持在90%以上，而隨著時(shí)間的延長和檸檬酸添加量的增加，已?；幕ㄇ嗨乇Ａ袈瘦^對照組有所增加。當(dāng)添加量達(dá)到30%時(shí)仍然維持在85%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的檸檬酸對已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。但已添加檸檬酸的已酰化花青素較未添加的穩(wěn)定性顯著（p＜0.05）提高，說明添加適量的檸檬酸對已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性有一定程度的增強(qiáng)作用。

圖10 檸檬酸對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響Fig.10 Effect of citric acid on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

2.5 金屬離子對藍(lán)莓中花青素穩(wěn)定性的影響

圖11 Na+、K+、Cu2+對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響Fig.11 Effect of Na+、K+、Cu2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

由圖11可知，與對照組相比，不同濃度的Na+、K+、Cu2+對已酰化藍(lán)莓花青素的保留率影響趨勢大致相同，10h后已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈试?5%以上。由方差分析可知，添加不同濃度的Na+、K+、Cu2+已酰化花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性差異（p＞0.05）。說明不同濃度的Na+、K+、Cu2+對花青素的穩(wěn)定性無顯著影響。

圖12 Ca2+對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of Ca2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

由圖12可知，隨著Ca2+濃度的增加，藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈式档挖厔葺^明顯，當(dāng)Ca2+濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，10h后已?；{(lán)莓花青素的保留率降低到75.01%，與對照組向比，花青素的保留率降低。由方差分析可知，添加不同濃度的Ca2+對已?；{(lán)莓花青素的穩(wěn)定性影響沒有顯著性性差異（p＞0.05）。但添加不同濃度的Ca2+對已?；{(lán)莓花青素的穩(wěn)定性較未添加的有顯著（p＜0.05）降低，因此添加Ca2+對已?；{(lán)莓花青素的穩(wěn)定性具有破壞作用

由圖13可知，濃度為0.01mol/L的Mg2+使已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈事愿哂趯φ战M，而當(dāng)濃度達(dá)到0.1mol/L的Mg2+則使已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈式档汀Ｓ煞讲罘治隹芍?，添加不同濃度的Mg2+對已酰化花青素的穩(wěn)定性影響有顯著性差異（p＜0.05）。說明低濃度的Mg2+對已酰化花青素具有一定程度的保護(hù)作用，而大于0.1mol/L的Mg2+對已?；ㄇ嗨鼐哂幸欢ǔ潭鹊钠茐淖饔?。與對照組相比，加入Fe3+的已酰化花青素保留率均呈現(xiàn)大幅度下降趨勢，且Fe3+濃度越大，已酰化花青素的保留率越低，當(dāng)Fe3+濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，10h后已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈式档?8.08%。由方差分析可知，添加不同濃度的Fe3+對已酰化花青素的穩(wěn)定性影響有顯著性差異（p＜0.05）。說明Fe3+對花青素的穩(wěn)定性的破壞作用隨濃度的增大而增加。與對照組相比，F(xiàn)e2+的濃度小于0.05mol/L時(shí)，對已?；ㄇ嗨氐谋Ａ袈薀o顯著影響，10h后均維持在80%左右；而當(dāng)濃度達(dá)到0.1mol/L時(shí)，F(xiàn)e2+會使已酰化花青素的保留率降低，10h后保留率為74.11%。由方差分析知，添加不同濃度的Fe2+對已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性有顯著性差異（p＜0.05）。說明濃度小于0.05mol/L的Fe2+對已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性影響較小，濃度達(dá)到0.1mol/L的Fe2+對已?；ㄇ嗨氐姆€(wěn)定性具有一定的破壞作用。

圖13 Mg2+、Fe3+、Fe2+對藍(lán)莓中已?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響Fig.13 Effect of Mg2+，F(xiàn)e3+，F(xiàn)e2+on the stability of acylated anthocyanins in blueberry

圖14 過氧化氫對已?；臀歹；{(lán)莓花青素穩(wěn)定性影響比較Fig.14 Effect of H2O2on the stability comparison between acylated anthoanins and proanidine

2.6 氧化還原劑對藍(lán)莓中已酰化和未?；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響比較

2.6.1 過氧化氫對藍(lán)莓中已?；臀歹；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響比較 由圖14可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，過氧化氫對已?；ㄇ嗨氐挠绊戯@著（p＜0.05），保留率下降明顯，反應(yīng)物顏色變淺，是因?yàn)檫^氧化氫為強(qiáng)氧化劑，與已酰化花青素反應(yīng)明顯。但添加相同濃度的過氧化氫，未?；幕ㄇ嗨乇纫氧；乃{(lán)莓花青素保留率下降趨勢快，因此，已?；乃{(lán)莓花青素對強(qiáng)氧化劑的穩(wěn)定性提高。

2.6.2 亞硫酸鈉對藍(lán)莓中已?；臀歹；ㄇ嗨胤€(wěn)定性的影響比較 由圖15可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，亞硫酸鈉對已?；ㄇ嗨氐挠绊戯@著（p＜0.05），保留率下降明顯，反應(yīng)物顏色變淺，是因?yàn)閬喠蛩徕c為強(qiáng)還原劑，與已酰化花青素反應(yīng)明顯。但添加相同濃度的亞硫酸鈉，未酰化的花青素比已?；乃{(lán)莓花青素保留率下降趨勢快，因此，已酰化的藍(lán)莓花青素對強(qiáng)還原劑的穩(wěn)定性提高。

Study on stability of acylated blueberries anthocyanins

ZHAO Li-yi1，2，LI Lu-ning1，2，SHEN Rui-meng1，2，ZHU Ning1，2，SUN Ai-dong1，2，*
（1.Department of Food Science，College of Biological Sciences and Biotechnology，Beijing Forestry University，Beijing 100083，China；2.Beijing Forestry University，key laboratory of Forestry Food Processing and Security，Beijing 100083，China）

The molecular modification of blueberry in this experiment was acylated by using dodecanoyl chloride. Meanwhile，these experiments studied the stabilities（temperature，illumination，additive，metal ion，strong oxidizer reducer） of anthocyanin acylation of blueberry，The studies indicated that acylated anthocyanins were improved obviously in the stabilities of temperature，illumination and strong oxidizer reducer comparing with the blueberry anthocyanin of no acylation.The experiments showed that adding different concentration gradients additive （VC，Sodium Benzoate，sucrose，glucose，sodium citrate） could improve the stabilities of acylated anthoanins.K+，Na+，Cu2+and Fe2+（concentration was lower than 0.05mol/L had no obvious affection to the acylated anthoanins’stabilities.Ca2+，F(xiàn)e3+and Mg2+，F(xiàn)e2+（concentration was lower than 0.1mol/L） had the destructive effects to the stabilities of acylated anthoanins.

blueberry anthocyanin；acylation；stability

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0299-06

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.057

2014－02－28

趙立儀（1991-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物生理活性的開發(fā)與利用。

* 通訊作者：孫愛東（1968-），女，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物生理活性的開發(fā)與利用。

國家自然基金資助項(xiàng)目（31271981）；科技部十二五課題（2012BAD31B05）。